随着经济的发展、生活水平的提高及老龄化社会的到来，心血管疾病的发病率日益上升，心肌纤维化是心血管疾病的一个重要病理特征，最终可引起心功能不全等一系列严重病理损害，甚至导致死亡^[1]。

细胞外基质沉积是心肌纤维化的主要病理特征，以往心肌纤维化的研究热点是胶原蛋白，然而除胶原蛋白外，透明质酸（hyaluronic acid，HA）也被认为是细胞外基质的重要成分。HA是一种自然形成的多聚糖，广泛分布于生物体内，由透明质酸合成酶合成^[2]。研究显示纤维化组织中HA明显增多，因此HA被认为是心肌纤维化的特征之一，作为心肌纤维化的产物，被动参与纤维化的发生发展^[3]。近年来随着对HA研究的进一步深入，尤其是一些研究证实HA不仅是纤维化的产物，更是作为纤维化的驱动因子，促进成纤维细胞的分化与增殖，主动参与心肌纤维化的发生发展^[4-6]。上述研究发现， HA根据其不同的分子量而具有不同的功能，目前HA大致可分为3种^[7]。初始合成的HA称为高分子量透明质酸（high molecular weight hyaluronic acid， HMW ⁃ HA）（＞1 000kDa），在生理状态下HA以HMW ⁃HA形式存在，在炎症刺激或病理状态下， HMW⁃HA在透明质酸酶作用下会降解为低分子量透明质酸（low molecular weight hyaluronic acid， LMW⁃HA）（6~20kDa），后者是一种有生物活性的片段^[8-10]。研究证实HMW⁃HA具有抗炎作用，保护细胞；LMW⁃HA则有致炎作用，促进细胞增殖及分化^[9，11]。

研究表明LMW⁃HA在细胞表面的特异性受体为CD44，其广泛分布于包括成纤维细胞在内的多种细胞中^[12]。在白细胞中，CD44与LMW⁃HA结合后仅15min即被覆盖到细胞的一极，同时HA进入细胞内^[9]。LMW⁃HA与其受体CD44相结合后在调控细胞增殖等方面起非常重要的作用^[13-14]，多项研究表明CD44与LMW⁃HA相互结合后可参与肺、肝脏及肾脏组织的纤维化病理进程中。细胞膜表面的CD44在膜相关金属蛋白酶（membrane ⁃ associated metalloprotease，MMP）作用下可以被水解，胞外段向血浆和细胞外液释放，而胞内结构域则被剪切下，通过核膜进入细胞核内，发挥相应的功能。近几年对核型CD44的研究主要集中在肿瘤干细胞领域^[15]，研究提示当CD44转入细胞核内时可启动下游信号，使得细胞发生程序重调，从而调控细胞分化与增殖^[13，16-17]。

S100A4蛋白是S100家族的一员，又称成纤维细胞特异性蛋白1，是器官纤维化的分子标志物，主要参与细胞的分化和增殖^[18]。在肿瘤、肺、肾脏、肝脏及心脏纤维化组织中明显表达，但具体机制不明^[19-20]。本课题组前期研究显示，缺氧刺激乳大鼠成纤维细胞及心梗小鼠模型中发现α⁃ SMA、 S100A4、β⁃catenin、Collegen 1和Collegen 3表达水平明显增高。而在心梗组小鼠心肌注射病毒转染S100A4敲低基因后，Masson染色提示胶原成分减少，超声心动图提示小鼠心功能明显改善^[21-22]。上述实验进一步证实了S100A4在心肌纤维化发生发展过程中起到非常重要的作用。

LMW⁃HA与CD44结合后可以调控细胞增殖，同时也已证明S100A4与心肌纤维化有关，因此我们提出假设：LMW⁃HA能够通过CD44作用于S100A4蛋白，使其进入细胞核内，从而启动下游信号通路参与心脏纤维化。

本研究旨在证明LMW⁃HA作为心肌纤维化的驱动因子，能促进小鼠心脏成纤维细胞（cardiac fi⁃ broblasts，CF）的分化与增殖，并明确其与细胞膜表面受体CD44结合后，能够诱导S100A4蛋白从胞浆进入细胞核内，最终促进心脏纤维化的发生，为针对HA和CD44的分子靶向治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

LMW ⁃ HA HA60K ⁃ 1（Lifecore公司，美国）； DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶、 BSA（Gibco公司，美国）；RIPA裂解液、PMSF、DEPC水、DAPI染色液、抗荧光猝灭封片液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS⁃PAGE凝胶配置试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（杭州碧云天公司）；青霉素⁃链霉素混合物（HyClone公司，美国）；Ⅱ型胶原酶（Worthington公司，美国）；封闭用羊血清（北京中杉金桥）；CCK⁃8细胞增殖⁃毒性检测试剂盒（DOJIN⁃ DO公司，日本）；抗HistoneH3、抗α⁃SMA（CST公司，美国），抗CD44（Abcam公司，美国），BRIC⁃235（ARP公司，美国），抗Collagen 3（上海Proteintech公司），抗GAPDH、抗S100A4、山羊抗兔IgG⁃HRP、山羊抗小鼠IgG⁃HRP（合肥Biosharp公司），AlexaFluor 488标记的羊抗兔IgG、AlexaFluor 594标记的羊抗小鼠IgG（Jackson ImmunoResearch公司，美国）；HiScript Ⅲ RT Super Mix for QPCR、Cham QSYBR qPCR Mas⁃ ter Mix（上海诺唯赞公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离与培养

CF和心肌细胞（myocardial cell，MC）从南京医科大学实验动物中心提供的出生1~3d的SPF级ICR乳小鼠的心脏中分离，本研究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准。分离出的细胞在含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中培养，培养箱温度为37℃、CO₂ 为5%。使用0.25%的胰酶进行消化传代，细胞传至第3代后随机分组，用于实验。

1.2.2 LMW⁃HA刺激

将LMW⁃HA溶于10%FBS的DMEM高糖培养基中混匀，CF用无血清的培养基饥饿过夜后，换成含有LMW⁃HA的培养基。

1.2.3 CD44抑制剂处理

将CD44抑制剂BRIC⁃235提前24h加入培养皿中，37℃、5%CO₂孵育24h后换成含有LMW⁃HA的培养基。

1.2.4 CCK⁃8细胞增殖实验

用胰酶将CF消化后进行细胞计数，在96孔板中按照每孔100 μL 3 000个细胞的密度加入细胞悬液，CF贴壁后加入LMW⁃HA刺激，一定时间后换成普通培养基继续孵育。向每孔加入10 μL CCK⁃8试剂，继续孵育1h后用酶标仪测定450nm处吸光度。

1.2.5 Western blot检测

针对细胞总蛋白，收取细胞并且冰上裂解，孵育15min，刮下蛋白后4℃ 12 000 g离心20min，收集上清液；使用试剂盒分别提取细胞浆蛋白与核蛋白。应用BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白经SDS⁃ PAGE电泳后转移到PVDF膜上。室温下5%BSA封闭1h后，一抗4℃摇床孵育过夜。第2天二抗孵育2h，使用ECL高敏化学发光试剂检测目的蛋白的表达。

1.2.6 实时定量PCR（qRT⁃PCR）检测

收取细胞并用TRIzol法提取mRNA，用试剂盒对总mRNA进行逆转录（37℃ 15min，85℃ 5s）合成cDNA。用SYBRGreen法进行qRT ⁃ PCR检测， 95℃预变性30s，95℃ 10s、60℃ 30s共40个循环，最后退火。采用StepOne Plus实时PCR系统进行分析。

1.2.7 免疫荧光检测

CF传代至共聚焦培养皿中，37℃ 5%CO₂孵育过夜。第2天用4%多聚甲醛固定30min，0.3%Triton X⁃100破膜15min，5%NGS室温封闭1h，加入一抗4℃摇床过夜。第2天吸弃一抗，全程避光，荧光二抗室温孵育1h，吸弃二抗，DAPI染核6min，封片，使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.3 统计学方法

每组数据均来自3次独立的实验，所有统计分析均使用SPSS25.0进行。正态分布数据采用均数± 标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，两组间比较采用双尾未配对t检验，多重比较采用单因素方差分析和Tukey检验，所有结果均使用GraphPad Prism 8.0表示。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44与S100A4在CF中高表达

首先检测ICR乳小鼠CF和MC中CD44和S100A4mRNA和蛋白的表达。 qRT⁃PCR对CD44和S100A4mRNA进行定量分析（图1A、B），Western blot对两者的蛋白进行定量分析（图1C~E）。结果表明，CF中CD44和S100A4的表达量均显著高于MC（P ＜0.01）。

2.2 LMW⁃HA刺激的最佳浓度

CCK⁃8细胞增殖实验显示（图2A），分别用不同浓度的LMW⁃HA刺激CF，当浓度≥0.2mg/mL时CF的增殖与对照组相比差异有统计学意义（P ＜0.05）， 0.8mg/mL LMW ⁃ HA作用下，CF的增殖最明显。 EdU染色法同样证明了0.2mg/mL的LMW⁃HA已经开始对CF的增殖产生影响（图2B）。因此，后续实验采用0.8mg/mL的LMW⁃HA对CF进行刺激并培养。

2.3 LMW⁃HA刺激后CF的表型转化

PCR和Western blot显示，CF中的心肌纤维化标志物α⁃SMA和Collagen 3的表达在LMW⁃HA刺激8h时开始增加，刺激12h时显著增加（P ＜0.01）； CD44mRNA和蛋白的表达不随时间变化（P ＞ 0.05）；LMW⁃HA刺激8h后S100A4mRNA和蛋白表达时开始缓慢增加（P ＜0.05），刺激12h后显著增加 （P ＜0.01，图3A、B）。采用α⁃SMA和S100A4细胞免疫荧光染色观察到，CF在LMW⁃HA的作用下向肌成纤维细胞分化（图3C）。

2.4 LMW⁃HA刺激使CD44 与S100A4 蛋白从胞浆进入胞核

为了研究CD44与S100A4蛋白是否从胞浆进入胞核，对细胞浆蛋白与核蛋白进行分离，然后通过Western blot证明，LMW⁃HA刺激仅15min后，胞浆中的CD44蛋白表达量即开始降低（图4A），同时胞核中的CD44蛋白逐渐增加（P ＜0.05，图4B），而S100A4蛋白在30min后的变化才有统计学意义 （P ＜0.01）。结合总蛋白的表达，可以得出CD44蛋白从胞浆进入了胞核，而S100A4核蛋白虽然也在合成，但是主要来源于胞浆。免疫荧光结果也能印证这2个蛋白的核转移（图4C）。

2.5 CD44 抑制剂存在时LMW⁃HA刺激后CF的表型转化

PCR和Western blot结果均显示，BRIC⁃235本身对细胞无影响，不会导致CF中的心脏纤维化标志物的增加（P ＞0.05，图5）。同时LMW⁃HA的刺激纤维化作用被逆转，α⁃SMA、Collagen 3和S100A4的表达不增加，CD44的表达依然不变（P ＞0.05）。

2.6 BRIC⁃235能抑制CD44与S100A4蛋白从胞浆进入胞核的过程

Western blot结果显示，BRIC⁃235预处理细胞24h，无论是否有LMW⁃HA的存在，胞浆和胞核中的CD44和S100A4蛋白的表达量均没有改变（P ＞ 0.05，图6A、B）。免疫荧光结果也证明了其对CD44和S100A4蛋白核转移的抑制作用（图6C）。

3 讨论

心肌纤维化是众多心血管疾病及心脏老化的一个重要的病理特征，导致的心室重构会严重影响心功能，目前药物治疗主要围绕阻断神经⁃内分泌系统抑制心室重构来展开^[23]，已知血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂均有逆转心室重构的作用，但其确切效果并不佳；此外，干细胞移植和基因治疗研究正在逐步深入，但疗效尚不确切^[24]。因此寻找抑制心肌纤维化逆转心室重构的新靶点迫在眉睫。

近年来细胞微环境的作用颇受关注。HA是细胞外基质的重要组成成分，本研究首先明确相较于MC，CF中的CD44与S100A4高表达，因此选择CF作为研究对象。接着，本研究发现LMW⁃HA可促进CF的表型转化，刺激8h后开始分化为肌成纤维细胞，促进心肌纤维化。进一步研究提示，LMW⁃HA刺激CF后1h，细胞核内的S100A4明显增多同时胞浆内的S100A4减少，并且细胞膜表面的特异性受体CD44也有此种趋势。我们根据以上结果推测， LMW⁃HA促进CF纤维化的机制可能与CD44的结合及S100A4的核转移相关。最后为明确该假设，本研究使用了CD44抑制剂BRIC⁃235重复上述实验，发现CF向肌成纤维细胞表型的转化被抑制，同时CD44与S100A4的核转移也未发生，表明LMW⁃HA促进CF纤维化的机制是与CD44结合并介导S100A4的核转移。

CD44是表观分子量85kDa的细胞膜糖蛋白，其结构类似于选择蛋白，其细胞外部分包含N端二硫键结合的结构域和O端糖基化的结构域。CD44是HA的主要细胞表面受体，其COOH末端的52个氨基酸对HA与CD44细胞外结构域的结合至关重要^[25]。BRIC⁃235作为CD44的特异性抗体，可抑制HA与CD44的结合^[26]。因此，BRIC⁃235具有作为心肌纤维化靶向治疗的潜力，可以阻断LMW⁃HA与CD44的结合，抑制CF向肌成纤维细胞分化。

本研究一方面创新性地提出HA作为细胞外基质的重要组成成分，不仅是心肌纤维化的产物，更是作为纤维化的驱动因子，促进成纤维细胞的分化与增殖，主动参与到心肌纤维化的发生发展中，为我们更好地理解心肌纤维化的病理机制提供了新思路。另一方面，心肌纤维化的治疗一直是心血管疾病治疗中的难点，而首次提出LMW⁃HA/CD44通过促进S100A4核转移，与CD44结合调节下游通路从而促进纤维化的机制，为将来进一步阐述缺血性心肌纤维化分子机制打下了研究基础，也为今后临床分子治疗提供理论基础和新的靶点。

然而，本研究依然有需要改进之处。首先，由于条件限制及时间紧张，本研究仅为体外细胞实验，后续在体实验模型并未能实现，未能进一步探讨病理状态下HA分解代谢对心功能的影响，以及相关分子治疗的安全性和有效性。其次，CD44与S100A4在细胞核内是通过激活何种下游通路来调控成纤维细胞的增殖，目前在心肌纤维化的领域尚无定论，需要更深入的研究。

综上所述，LMW⁃HA具有高度致炎作用，而其与成纤维细胞膜特异性受体CD44结合后进一步形成了纤维化的驱动力，通过诱导S100A4蛋白向细胞核内转移，促进小鼠成纤维细胞的表型转化从而诱导心肌纤维化的发生。

参考文献