乳腺癌一直是欧美国家女性恶性肿瘤死亡的第一大原因^[1]。浸润性乳腺癌是指癌细胞已穿破乳腺导管或小叶腺泡的基底膜并侵入间质的一种恶性肿瘤。浸润性乳腺癌绝大多数为腺癌，起源于乳腺实质上皮细胞，特别是乳腺末梢导管小叶单位^[2]。蒽环类药物在浸润性乳腺癌的治疗中具有重要地位^[3]，但是近年来大量文献提示部分蒽环类药物出现选择性不高的情况^[3]。因此，找出有效的分子生物学标志物将有助于临床个体化治疗的精准选择。

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor⁃2，HER2），为表皮生长因子受体家族成员之一。HER2高表达的肿瘤表现出较强的转移能力和浸润能力，化疗敏感性也较低^[4-5]。目前在乳腺癌、卵巢癌、胃肠道癌和肺癌中都发现了HER2表达异常^[6]。现有的检测方法主要有免疫组化（immunohistochemistry，IHC）、荧光原位杂交技术 （fluorescence in situ hybridization，FISH）等，而FISH是目前检测HER2基因扩增水平的金标准^[7]。

本研究拟采用数据库预测HER2mRNA在浸润性乳腺癌中的表达情况，并与Ki67mRNA表达水平进行关联性分析；Nanostring nCounter技术检测53例浸润性乳腺癌福尔马林固定的石蜡样本（forma⁃ lin fixed paraffin sample，FFPE）组织标本中HER2mRNA的表达情况，并与蒽环类化疗药物的疗效进行关联性分析；进一步通过222例浸润性乳腺癌临床病理资料，寻找有效的分子生物学标志物，以期有助于对临床个体化治疗。

1 材料和方法

1.1 材料

收集马鞍山市中心医院病理科2013年1月— 2015年12月手术或穿刺获得的53例浸润性乳腺癌石蜡标本。患者均为女性，有完整的临床病理资料，患者均仅进行蒽环类药物化疗。同时收集马鞍山市中心医院病理科2008年1月—2012年12月浸润性乳腺癌的组织蜡块222例，具有完整的临床病理信息，包括绝经情况、肿瘤部位、雌激素受体（es⁃trogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone recep⁃ tor，PR）、HER2、Ki67表达、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分析、蒽环类药物化疗相关信息以及生存预后情况等，随访截至2017年12月。临床查体和乳腺超声检查评价疗效标准参照RECIST2000（实体瘤客观疗效评定标准）^[8]：完全缓解（complete remis⁃ sion，CR）：所有目标病灶完全消失并保持4周以上； 部分缓解（partial remission，PR）：治疗后目标病灶长径之和缩小30%以上并保持4周以上；疾病进展 （disease progression，PD）：治疗后目标病灶长径之和增加20%以上或出现新病灶；疾病稳定（diseuse sta⁃ bility，SD）：治疗后目标病灶长径之和缩小不超过30%或增加不超过20%并保持4周以上。客观有效=CR+PR；客观无效=PD+SD。本研究方案经马鞍山市中心医院伦理委员会批准（2019⁃0653）。患者基本信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析

在线数据库基因表达图谱关联分析（the online database gene expression profiling interactive analysis， GEPIA）是一个新开发的互动网站，使用一套标准程序分析来自TCGA和GTEx data（http：//gepia.cancer pku.cn/detail.php）的9 736个肿瘤和8 587个正常样本的mRNA测序数据。本文利用GEPIA数据库生成点图和箱线图。

1.2.2 Nanostring nCounter样本制备

对53例乳腺癌组织及癌旁对照组织的FFPE进行Nanostring nCounter多基因分析。根据HE染色切片，手工切除蜡块中的非肿瘤成分。根据石蜡组织的高纯度RNA提取试剂盒（厦门艾德公司）的操作说明进行RNA抽提，并进行杂交、纯化和计数。采用nCounter GX Human Kinase Kit（NanoString Technologies公司，美国）进行基因表达分析。数字化成像分析仪进行mRNA分子计数，本次实验计数方式以视野（fields of view，FOV）来表示，并采用280FOV进行计数。按照操作说明和实验要求进行实验操作和结果分析。样品加样量为100ng，选取3个管家基因（CLTC、GAPDH、β⁃tubulin）表达的均值校正样品表达量水平，探针序列见表2。

1.2.3 免疫组化（SP法）

制备石蜡切片，60℃烘烤1.5h。滴加HER2抗体（RMA ⁃0690，1∶100，福州迈新公司）、Ki67抗体 （ZM⁃0166，1∶100，北京中杉金桥公司），室温孵育1~2h，采用DAB显色，梯度乙醇脱水二甲苯脱蜡，中性胶密封。HER2评分++的样本继续进行HER2的FISH检测，进一步判断HER2的表达情况，分为HER2高表达和低表达。Ki67根据IHC的评分，<5%为（-），>5%为（+）。

1.3 统计学方法

应用SPSS21.0统计软件，计数资料的组间比较及相关性分析用χ² 检验，生存分析采用Kaplan⁃Meier法进行分析并进行Log⁃rank检验，所有统计学检验均为双侧检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GEPIA数据库分析HER2 基因在浸润性乳腺癌中的表达情况

为评估HER2基因在浸润性乳腺癌中的表达情况，本研究使用GEPIA数据库分析HER2mRNA在浸润性乳腺癌组织和正常组织中的表达，结果显示HER2mRNA高表达患者的整体预后情况比HER2mRNA低表达患者差，但是差异并没有统计学意义 （P=0.900，Cut⁃off=50%，图1A）；进一步利用相关性分析发现，HER2mRNA的表达和Ki67mRNA的表达水平具有相关性（P=0.007，r=0.079，图1B）。

2.2 Nanostring nCounter技术检测53例浸润性乳腺癌组织标本中HER2 mRNA的表达情况

本研究收集了53例浸润性乳腺癌石蜡标本和23例配对癌旁组织，利用Nanostring nCounter技术检测HER2mRNA的表达水平。乳腺癌组织中HER2mRNA表达水平高于癌旁组织。癌旁组织HER2mRNA表达量为716.74 ± 528.15。根据癌旁组织HER2mRNA均值，将肿瘤组织HER2mRNA结果分为高表达和低表达，结果显示在53例浸润性乳腺癌组织标本中HER2mRNA高表达16例 （30.19%），HER2mRNA低表达37例（69.81%），两组差异有统计学意义（P< 0.001）。将Nanostring nCounter检测结果和蒽环类化疗药物的效果进行分析，结果发现，HER2mRNA高表达患者3例 （18.80%）有效，13例（81.20%）无效，HER2mRNA低表达患者中19例（51.35%）有效，18例（48.65%）无效，差异有统计学意义（χ²=4.174，P=0.039，表3）。

2.3 HER2 低表达及Ki67 高表达预示着浸润性乳腺癌患者较好的化疗疗效及预后情况

收集浸润性乳腺癌的组织蜡块222例，通过免疫组化依据HER2和Ki67的表达情况分为4组： HER2^-/Ki67^- 44例，HER2^-/Ki67⁺ 107例，HER2⁺/Ki67^- 32例，HER2⁺/Ki67⁺ 39例。结果发现HER2与Ki67的表达情况与肿瘤大小（χ²=10.993，P=0.012）、淋巴结转移（χ²=17.488，P=0.001）、远处转移（χ²=14.797，P=0.002）、TNM分期（χ²=18.627，P=0.005）以及蒽环类药物化疗疗效（χ²=22.075，P=0.001）相关，而与肿瘤部位、绝经情况、ER、PR等临床病理情况无关（表4）。生存预后分析显示，HER2^-/Ki67⁺ 的浸润性乳腺癌患者有较好的生存期（log⁃rank=16.675，P=0.001，图2）。

3 讨论

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展具有高度异质性，因此识别特异性的生物标志物，用于早期诊断、指导临床治疗以及提高患者生存率至关重要。蒽环类药物广泛应用于治疗实体肿瘤，它可以通过阻碍快速生长的癌细胞分裂从而发挥抗癌作用，是公认的治疗乳腺癌最有效的药物之一，以蒽环类为主的乳腺癌化疗方案是目前国际最常用的联合化疗方案^[8-9]。

HER2是一种跨膜糖蛋白，其高表达被认为可能导致肿瘤细胞转移，并使得肿瘤细胞不易被药物杀死；但也有一些文献报道，HER2高表达患者对蒽环类药物具有敏感性^[10]。因此，寻找出有效的分子生物学标志物将有助于对临床个体化治疗的精准选择。本研究通过对GEPIA数据库的在线分析，发现HER2高表达的浸润性乳腺癌患者生存情况差于HER2低表达患者，但差异没有统计学意义（HER2高表达535例，HER2低表达535例，P=0.900）。继续进行关联性分析发现，HER2的表达和Ki67的表达具有相关性。这些结果提示，HER2和Ki67在浸润性乳腺癌细胞中的表达及作用可能存在相关性。

收集临床53例乳腺癌FFPE组织样本采用Nanostring nCounter技术检测HER2基因的表达状态。结果显示，53例浸润性乳腺癌组织标本中，HER2高表达16例（30.19%），HER2低表达37例 （69.81%）。荧光条形码分子计数分析系统是Nanostring公司的nCounter系统，基于数字式荧光条形码技术，可直接检测条形码探针标记的单个mRNA转录子，并通过数字计数进行定量^[11]。与实时定量PCR和微阵列等技术相比，该技术所需的工作时间短、工作量少、对样本质量的需求低。由于该系统具有敏感性高、可重复性等优点，更适用于检测那些保存不当、核酸提取困难的石蜡标本中的基因表达水平，也能检测FFPE组织样本中基因的mRNA表达水平^[12-13]。2014年3月，由美国辉瑞公司进行的一项对肺癌ALK、ROS1和RET融合基因进行检测，113例标本中3种融合基因分别用FISH和Nanostring nCounter技术检测后，结果的一致性达到100%^[14]。

进一步将Nanostring nCounter检测结果和蒽环类化疗药物的效果进行分析，结果显示，HER2mRNA低表达患者中19例（51.35%）化疗有效，18例 （48.65%）化疗无效，HER2mRNA高表达患者中，3例化疗有效（18.80%），13例化疗无效（81.20%），差异有统计学意义。本研究结果提示，对比HER2mRNA高表达的浸润性乳腺癌患者，HER2mRNA低表达患者较易在蒽环类药物化疗中获益。鉴于本研究的入组病例较少，我们继续收集了2008年1月 —2012年12月具有完整临床病理资料浸润性乳腺癌的组织蜡块222例，从蛋白表达层面进行分析，结果提示HER2/Ki67的蛋白表达情况与肿瘤大小（χ²=10.993，P=0.012）、淋巴结转移（χ²=17.488，P=0.001）、远处转移（χ² =14.797，P=0.002）、TNM分期 （χ²=18.627，P=0.005）以及蒽环类化疗疗效（χ²=22.075，P=0.001）相关，进一步证实了mRNA的结果。Biesaga等^[15] 对172例早期乳腺癌患者的病理资料进行回顾性分析发现，蒽环类药物化疗疗效较好的乳腺癌患者具有较高的无病生存率。

HER2表达情况和乳腺癌化疗疗效还没有较为一致的看法^[16]，而Ki67是一种增殖细胞相关抗原，与有丝分裂密切相关。临床上Ki67主要用于标记增殖周期中的细胞，阳性率越高代表肿瘤生长越快，组织分化能力越差^[17]。研究认为，Ki67表达水平能预测蒽环类药物化疗疗效^[18]。本研究对222例浸润性乳腺癌患者进行临床病理资料分析，结果发现HER2^-/Ki67⁺ 患者的蒽环类化疗疗效有效率达到52.1%（61/121），高于HER2^-/Ki67^- （26.4%，32/121）、HER2⁺/Ki67^- （10.7%，13/121）及HER2⁺/Ki67⁺ （10.7%，13/121）患者，差异有统计学意义；进一步生存分析的结果也显示，HER2^-/Ki67⁺ 的浸润性乳腺癌患者有较好的生存期。

基于肿瘤异质性以及复杂的肿瘤微环境，通过多个分子组合进一步对肿瘤进行分子分型变得越来越重要^[19]。目前，基因分子分型研究已广泛应用于乳腺癌^[20]、髓母细胞瘤^[21]、淋巴瘤^[22]、结直肠癌^[22] 等多种恶性肿瘤，其中针对乳腺癌基因表达谱的分子分型已应用于临床。基于Nanostring技术开发的乳腺癌分子分型表达谱PAM50已相继通过FDA和欧盟的审批，这一表达谱将乳腺癌分为管腔A型（lumi⁃ nal A）、管腔B型（luminal B）、HER⁃2富集型（HER⁃2Enriched）及基底样型（Basal⁃1like），相比标准的病理学参数，能更准确地预测乳腺癌患者的10年无病生存时间^[20，24]。

综上所述，本研究通过数据库、mRNA和蛋白3个方面探讨浸润性乳腺癌中HER2/Ki67的表达与蒽环类药物疗效及临床病理资料的关联。本研究结果支持HER2^-/Ki67⁺ 表达作为浸润性乳腺癌患者蒽环类化疗反应的预测标志物，并提示该类患者有较好的生存预后情况。

参考文献