随着放射技术在军事、医药和其他行业的大量应用，急性放射综合征（acute radiation syndrome， ARS）的研究也越来越受到人们的重视。放射造成造血系统损伤，导致骨髓造血功能障碍，严重时可危及生命。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesen⁃ chymal stem cells，BM⁃MSCs）作为骨髓造血微环境的重要组成部分，其自身及其后代子细胞可为造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）提供物理支撑。此外，BM⁃MSCs也可通过分泌多种造血/细胞因子，对HSCs的自我更新、分化及骨髓定植均发挥重要作用^[1-3]。目前认为，相较于HSCs，BM⁃MSCs具有较强的放射抗性，其相关的放射抗性机制主要包括： DNA损伤的有效识别，双链断裂修复及细胞凋亡逃逸等，但目前其具体机制尚未被完全阐明^[4]。鉴于BM⁃MSCs的存活可为放射损伤后造血重建提供基质干细胞基础，因此，深入研究其放射抗性机制，对探索骨髓型急性放射病救治的新策略具有重大意义。

生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF⁃β）超家族中的一员，在各种细胞和组织中广泛分布，伴随着不同的应激反应，如炎症、心脏缺血再灌注、急性组织损伤、放射、癌症等，GDF15的表达会大幅增加^[5-9]。既往研究表明，GDF15在部分癌细胞中高表达，并且在癌症的不同进展阶段具有促凋亡和抗凋亡两种效应^[10-12]。本课题组前期研究结果显示，BM⁃MSCs放射后，GDF15的表达显著升高^[13]，其是否在BM⁃MSCs的放射抗性中发挥关键作用，目前尚不清楚。本研究考察了放射后上调的GDF15表达在BM⁃MSCs放射抗性中的作用，并初步探讨了其可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人BM⁃MSCs、人BM⁃MSCs培养基（ScienCell公司，美国），人GDF15干扰片段（广州锐博生物科技有限公司），逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ 试剂盒（大连宝生物工程有限公司），Western blot转膜液、一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS⁃PAGE凝胶电泳配制试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒JC⁃1 （上海碧云天生物技术有限公司），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），PI staining检测试剂盒、Annexin V⁃PE/7AAD凋亡检测试剂盒（BD公司，美国），CCK⁃8（同仁化工，日本），Lipofectamine3000试剂（Invitrogen公司，美国），GDF15、p ⁃ ERK1/2、 ERK1/2抗体（Abcam公司，美国），Caspase3、Cleaved caspase3抗体（CST公司，美国），Bcl⁃2、Bax、β⁃actin抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BM⁃MSCs使用专用BM⁃MSCs培养基培养，原代细胞复苏于T⁃75细胞培养瓶中，37℃，5%CO₂的培养箱中培养，视为P1代细胞。细胞融合度达到85%~90%，1∶3传代为P2代细胞。本研究使用P6~P10代细胞进行后续细胞实验。

1.2.2 细胞分组及放射处理

实验分为3组：空白对照组、干扰对照组和干扰GDF15组。采用Co⁃60 γ射线对细胞进行放射处理，处理剂量为9Gy，剂量率为0.65Gy/min^[14]。

1.2.3 GDF15 siRNA干扰片段转染BM⁃MSCs

取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，融合度在70%。按Lipofectamine3000试剂说明书的比例配比各试剂，室温孵育15min，加入6孔板中，24h后收集细胞检测mRNA的表达，72h后收集细胞检测蛋白的表达。GDF15干扰片段靶序列如下：干扰片段1：5′⁃CCATGGTGCTCATTCAAAA⁃3′；干扰片段2：5′⁃GACTCCAGATTCCGAGAGT⁃3′；干扰片段3： 5′⁃CCAACTGCTGGCAGAATCT⁃3′。

1.2.4 蛋白免疫印迹分析（Western blot）检测蛋白表达

收集细胞，PBS洗1次，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白；冰上裂解30min，10 000 g 4℃离心15min，收上清；BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，加入1/5体积蛋白上样缓冲液，煮沸10min，使蛋白变性。根据目的蛋白分子量配制浓度为12%的SDS⁃PAGE凝胶，按照30 μg总蛋白上样，100V电泳，200mA转膜；5%BSA室温封闭1h，一抗孵育4℃过夜，抗体使用浓度：GDF15抗体（1∶1 500）、 p⁃ERK1/2、ERK1/2、Caspase3、Cleaved caspase3、Bcl⁃ 2、Bax、β⁃actin抗体（1∶1 000），TBST洗膜3次，二抗室温孵育2h，洗膜3次，ECL显影曝光并拍照，实验重复3次。

1.2.5 RT⁃qPCR检测mRNA水平

收集细胞，每管加入1mL TRIzol试剂提取细胞总RNA，移液枪反复吹打直至无明显沉淀，室温裂解30min；加入上述裂解液体积1/5的氯仿，涡旋室温静置15min，10 000 g 4℃离心15min；取上层无色液体转移至新的无酶EP管中，向上述无色液体中加入同等体积异丙醇，混匀室温静置10min，10 000 g 4℃离心10min，弃上清；加入800 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500 g 4℃离心10min，弃上清，室温干燥沉淀；加入20 μL DEPC水，溶解RNA，测RNA浓度。按照TaKaRa的逆转录试剂盒说明书操作步骤反转录得到cDNA，进行RT⁃qPCR。引物序列：GDF15上游：5′ ⁃GACCCTCAGAGTTGCACTCC ⁃ 3′，下游：5′ ⁃ GCCTGGTTAGCAGGTCCTC ⁃ 3′；β ⁃ actin上游：5′ ⁃ AGCCTCGCCTTTGCCGA⁃3′，下游：5′⁃CTGGTGCCT⁃ GGGGCG⁃3′，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞，1.5×10⁵ 个/孔接种于6孔板中，接种24h后转染各组细胞；9Gy放射处理，24h后收集细胞，1 000r/min离心5min，冰PBS清洗3次； 根据凋亡检测试剂操作说明书，按照每孔100 μL结合液，5 μL Annexin V⁃PE和5 μL 7⁃AAD配制检测液，分别加入各组细胞中，重悬混匀，室温避光孵育15~30min，流式细胞仪检测，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期细胞，接种于25cm² 细胞瓶中，细胞融合度达60%转染各组细胞；9Gy放射处理，24h后收集细胞，1 000r/min离心5min，PBS清洗3次， 75%冰乙醇固定，4℃冰箱过夜；PBS洗3次，PI染色，重悬混匀，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.8 CCK⁃8检测细胞增殖

取对数生长期细胞，2 000个/孔接种于96孔板中，24h后转染各组细胞，9Gy放射处理；72h后弃培养基，按照每孔100 μL培养基，10 μL CCK⁃8试剂配制检测液，分别加入96孔板中，37℃避光孵育2h，酶标仪450nm检测吸光度，每组5个复孔，实验重复3次。

1.2.9 免疫荧光染色

取对数生长期细胞2×10⁴ 个/孔接种于激光共聚焦皿中，24h后转染各组细胞，9Gy放射处理；分别收取未放射、放射后8h和放射后24h 3个时间点细胞；弃培养基，PBS洗1次，37℃ 4%多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3次；0.2%Triton X⁃100破膜30min， PBS洗3次：5%BSA封闭1h；GDF15一抗（1∶200） 4℃孵育过夜，PBS洗3次；二抗37℃避光孵育3h， PBS洗3次；DAPI染色10min，室温避光，PBS洗3次；抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照，实验重复3次。

1.2.10 线粒体膜电位检测

取对数生长期细胞，2×10⁴ 个/孔接种于24孔板中，24h后转染各组细胞，9Gy放射处理；分别收取未放射、放射后8h细胞。阳性对照设置：阳性对照孔中加入碳酰氰基⁃对⁃氯苯腙（CCCP，使用浓度为10 μmol/L）处理细胞20min。吸除培养基，PBS洗1次，加入500 μL JC⁃1染色工作液，细胞培养箱中孵育20min；吸除上清，PBS洗2次，加入1mL细胞培养液，荧光显微镜观察拍照，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验计量数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示。同一测量值在不同的时间比较采用重复测量的方差分析；两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析和LSD⁃t 检验，方差不齐数据采用Tamhane’s T2检验进行比较。P ˂ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放射诱导BM⁃MSCs中GDF15表达上调

为明确放射后BM⁃MSCs中GDF15的表达情况，分别通过RT⁃qPCR、Western blot和免疫荧光检测细胞经放射处理后不同时间点GDF15的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，GDF15的mRNA和蛋白水平在放射后显著升高（图1A、B）。同时，免疫荧光的结果也证实，放射可诱导GDF15的表达增加（图1C）。综上，在BM⁃MSCs细胞经放射诱导后GDF15的表达上调。

2.2 GDF15干扰效果验证

为明确放射后高表达的GDF15在BM⁃MSCs放射抗性中的作用，我们采用脂质体转染siRNA片段干扰GDF15的表达，并于细胞转染24h后，进行mRNA检测。结果显示，与干扰对照组相比，3个干扰片段均能有效降低GDF15的mRNA表达水平（P ˂ 0.05，图2A），其中干扰片段1的mRNA抑制效率达到75%；细胞转染72h后，进行蛋白检测，结果显示，与干扰对照组相比，3个干扰片段均能有效降低GDF15蛋白表达（P ˂ 0.05，图3B、C）。综合上述结果，干扰片段1的抑制效果最好，并拟采用此片段进行后续的干扰实验。

2.3 干扰GDF15的表达可降低BM⁃MSCs放射后细胞增殖

为明确GDF15表达水平对放射前后细胞增殖的影响，我们检测了细胞周期和细胞增殖活力。收取未放射和放射后24h的BM⁃MSCs细胞，通过PI染色检测细胞周期，结果显示，未放射条件下，干扰GDF15对BM⁃MSCs周期无明显影响；放射后24h时，干扰GDF15组G2期比例显著增加（P ˂ 0.05，图3A、B）。收取放射3d后的细胞，CCK⁃8法检测细胞增殖活力，结果显示与细胞周期结果相符，干扰GDF15几乎不影响未放射时的细胞增殖活力，却可导致放射后BM⁃MSCs细胞增殖活力显著降低（P ˂ 0.01，图3C）。综上所述，干扰GDF15基因表达可导致放射后BM⁃MSCs细胞G2期阻滞并且降低细胞增殖活力。

2.4 干扰GDF15表达可增加BM⁃MSCs放射后细胞凋亡

为进一步明确GDF15表达对BM⁃MSCs放射抗性的影响，我们通过Annexin V⁃PE/7AAD染色及检测Cleaved caspase3和JC ⁃ 1变化水平，明确干扰GDF15表达对BM⁃MSCs放射后细胞凋亡的影响。检测结果如图4A、B所示，未放射条件下，干扰GDF15表达对细胞的凋亡无显著性影响。而放射后，干扰GDF15可导致细胞凋亡率显著增加（P ˂ 0.05）。与之相应，Cleaved caspase3的Western blot结果证实，干扰GDF15可使放射后Caspase3的剪切水平增加（图4C）。同时，检测JC⁃1细胞线粒体膜电位的变化情况发现，在未放射条件下，对照组与干扰GDF15红/绿荧光强度比值无统计差异（P ˃ 0.05）。而放射后，干扰GDF15组与其干扰对照组相比，红/绿荧光强度比值显著降低，提示线粒体膜电位下降（P ˂ 0.001，图5）。上述结果表明，干扰GDF15表达可显著增加BM⁃MSCs细胞放射后凋亡。

2.5 干扰GDF15表达可抑制BM⁃MSCs的ERK/Bcl⁃ 2信号通路活化

为进一步明确干扰GDF15表达增加BM⁃MSCs放射敏感性的分子机制，我们检测了GDF15下游与细胞凋亡密切相关的关键通路ERK/Bcl⁃2的活化情况^[15]。Western blot检测结果表明：与空白对照组和干扰对照组相比，干扰GDF15后，ERK1/2磷酸化水平明显降低，表明GDF15可以通过增加ERK1/2的磷酸化调节其下游蛋白的表达。与对照组相比，干扰GDF15导致抗凋亡关键分子Bcl⁃2蛋白水平明显降低，而促凋亡分子Bax蛋白水平明显升高（图6）。综上所述，干扰GDF15表达可通过抑制ERK信号通路活化，调节下游Bcl⁃2和Bax蛋白表达，进而增加BM⁃MSCs放射后凋亡。

3 讨论

在ARS的研究中，骨髓造血损伤是各种放射病最基本和最致命的表现之一，并贯穿各型ARS的始终^[16]。因此，对于骨髓造血功能损伤的防治是ARS防治的关键和重要研究领域。BM⁃MSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，可以分化为包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞和成纤维细胞在内的骨髓基质细胞，以形成HSCs骨髓内定植的龛位，也可分泌多种造血因子、细胞因子和趋化因子建立细胞因子网络，对于正常造血功能的维持和损伤后造血重建都至关重要^[17]。因此研究BM⁃ MSCs的放射抗性，对于造血重建具有重大意义。

凋亡是放射诱导细胞死亡的主要原因之一，而BM⁃MSCs对凋亡的抗性被认为是放射耐受的关键机制。已有研究表明，放射后BM⁃MSCs的抗凋亡作用与较强的DNA损伤修复能力和较快的活性氧清除有关^[18]。我们前期研究发现，GDF15升幅高的BM⁃MSCs凋亡率较低^[13]，提示GDF15可能参与BM⁃ MSCs的放射抗性，但具体机制未明。本研究发现放射可诱导BM⁃MSCs中GDF15表达显著上调，而干扰其表达可导致放射后细胞凋亡率增加，证实GDF15可促进细胞的放射抵抗。细胞对放射的敏感性与所处的周期密切相关，处于G1/S期的细胞放射敏感性低，处于G2期的细胞放射敏感性高^[19]。已有文献报道，GDF15参与细胞周期的调控。如在宫颈癌细胞中，GDF15诱导c⁃Myc的表达，c⁃Myc作为调节细胞周期的经典转录因子，可诱导CDK1和cyclinB1的上调，CDK1⁃cyclinB1形成复合物促进细胞通过G2期^[7，20]。本研究也证实干扰GDF15，放射后BM ⁃ MSCs的G2期阻滞增加。但是否GDF15通过该机制参与放射后BM⁃MSCs的G2期调控有待进一步研究。

线粒体是放射损伤的重要靶点。放射可直接作用于线粒体DNA，也可间接通过辐解产生的活性氧损伤线粒体的蛋白及细胞膜系统，破坏电子传递链（ETC）复合物Ⅰ、Ⅱ等，从而导致线粒体膜通透性改变、融合⁃分裂动态平衡失衡、线粒体膜电位下降等一系列结构和功能损害^[21]。此外，GDF15也是线粒体功能损伤的标志物^[22]。因此，我们检测了干扰GDF15对放射前后线粒体膜电位以及Caspase3剪切情况的影响。正常的线粒体膜电位是维持线粒体功能的关键，而其膜电位的降低是细胞凋亡早期的一个标志性事件^[23]。本研究结果显示干扰GDF15对正常BM⁃MSCs线粒体膜电位无显著影响，但放射后却可以显著降低线粒体膜电位。此外，干扰GDF15的BM⁃MSCs放射后Cleaved caspase3水平最高。综上所述，干扰GDF15诱导BM⁃MSCs放射敏感性增加可能与线粒体凋亡途径增强有关。

ERK信号通路在BM⁃MSCs的增殖、分化和凋亡中具有重要作用。抑制ERK1/2磷酸化可通过调控Bax和Bcl⁃2表达水平，激活Caspase3，导致细胞凋亡^[24]。在多种肿瘤细胞中，已有研究证实GDF15可结合酪氨酸激酶受体ErbB2，激活ErbB2的激酶活性，进而磷酸化ERK1/2调控细胞增殖^[7，25]。因此，我们检测了在BM⁃MSCs中GDF15对ERK1/2磷酸化的影响，结果显示干扰GDF15抑制了ERK1/2的磷酸化水平。ERK1/2对细胞凋亡的调控主要通过对Bcl⁃2和Bax蛋白调节实现。研究表明，ERK1/2依赖性磷酸化可以激活cAMP反应性元素结合蛋白 （CREB），磷酸化的CREB入核并与Bcl⁃2的启动子结合，从而促进Bcl⁃2转录^[24]。当Bcl⁃2表达较Bax多时，两者可以结合形成异源二聚体，抑制细胞的凋亡，而Bcl⁃2表达较Bax少时，Bax自身会形成同源二聚体，促进细胞的凋亡^[27]。既往研究表明，与放射敏感性细胞相比，MSCs高表达抗凋亡蛋白Bcl⁃2，低表达促凋亡蛋白Bax^[1]。因此，本研究检测了干扰GDF15之后，Bcl⁃2和Bax在BM⁃MSCs中的表达。干扰GDF15后Bcl⁃2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，表明GDF15对BM⁃MSCs放射抗性的调控可能通过ERK/Bcl⁃2通路实现。

综上所述，本研究证明了GDF15作为放射应激分子，通过激活ERK/Bcl⁃2通路活性，参与BM⁃MSCs的放射抗性调控，为放射后造血微环境的重建提供了调控靶分子。然而，BM⁃MSCs细胞中GDF15影响ERK磷酸化的具体机制尚不清楚，有待进一步的研究探索。

参考文献