丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）作为人体细胞中占比最高的磷酸酶，在恶性肿瘤的发生和转移过程中发挥重要的作用，通常被作为一种抑癌因子进行研究^[1]。流行病学调查显示，作为PP2A核心基础的催化亚基α亚型PP2Acɑ，其编码基因PPP2CA突变与胃癌发生相关^[2]。

N6⁃甲基腺苷（N6⁃methyladenosine，m6A）修饰是细胞中最为重要且保守的RNA修饰^[3]。生物信息学研究表明，作为m6A甲基转移酶复合物的桥接蛋白WTAP，其高表达与胃癌的不良预后密切相关^[4]。

PP2A可以通过抑制细胞 ⁃ 髓细胞症病毒性癌基因（cellular⁃myelocytomatosis viral oncogene，c⁃Myc）、 B细胞淋巴瘤/白血病⁃2基因（B⁃cell leukemia/lym⁃ phoma2，BCL）等癌基因或者癌蛋白的表达^[5-7]，从而发挥抑癌作用；WTAP却往往会上调癌基因或者癌蛋白的水平^[8-11]。二者在恶性肿瘤中均扮演重要角色，但作用大相径庭，而且在胃癌中均无相关基础研究，并缺乏相互关系的探索。因此，本文着重于研究抑制PP2Acα是否会影响胃癌细胞的恶性表型，以及在此过程中WTAP的表达。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞系BGC⁃823（人胃腺癌细胞，低分化，上海碧云天生物公司）；慢病毒（上海凯基生物公司）；结晶紫染液（上海碧云天生物公司）；PCR引物（南京金斯瑞生物公司）；划痕小室（易必迪公司，德国）；侵袭小室（康宁公司，美国）；RNA抽提试剂盒（离心柱式，上海碧云天生物公司）；RT⁃qPCR试剂盒（南京诺唯赞生物公司）；抗PP2A ⁃Cα/β抗体 （Santa Cruz公司，美国）；抗WTAP抗体（Proteintech公司，美国）；抗β⁃actin抗体（Santa Cruz公司，美国）； 二抗（Rockland公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人胃癌细胞系BGC⁃823，在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的培养基中培养。各组细胞均在37℃、5％CO₂加湿培养箱中培养。

1.2.2 慢病毒介导的shRNA转染细胞

根据BGC⁃823的感染复数值（multiplicity of in⁃ fection，MOI），BGC⁃823细胞的MOI值为100，用慢病毒介导的shRNA转染胃癌细胞，敲减PPP2CA基因，进而抑制PP2Acα的表达。转染48h后收获细胞。然后用嘌呤霉素筛选出阳性表达的细胞，嘌呤霉素筛选浓度为2 μg/mL。实验所用shRNA序列如下： sh ⁃ PPP2CA ⁃1，5′ ⁃GATCCGTGGAACTTGACGATA⁃ CTCTAACTCGAGTTAGAGTATCGTCAAGTTCCATT⁃ TTTT⁃3′；sh⁃PPP2CA⁃2，5′⁃GATCCGCAGATCTTCT⁃ GTCTACATGGTTCAAGAGACCATGTA ⁃ GACAGAA⁃ GATCTGCTTTTTTG⁃3′；sh⁃PPP2CA⁃3，5′⁃GATCCG⁃ GCAAATCACCAGATACAAATTTCAAGAG ⁃ AATTT⁃ GTATCTGGTGATTTGCCTTTTTTG⁃3′。

1.2.3 定量逆转录PCR

使用RNA抽提试剂盒（离心柱式）从培养的胃癌细胞中分离总RNA，然后使用Hiscrip^®RT试剂盒，按照手册将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用分光光度计测量RNA的浓度。用荧光定量PCR试剂盒在ABI StepOnePlus^TM 实时PCR系统上进行qPCR实验。引物序列如下：GAPDH，5′⁃GGAGC⁃ GAGATCCCTCCAAAAT ⁃3′（正向引物），5′⁃GGCT⁃ GTTGTCATACTTCTCATGG⁃3′（反向引物）；WTAP， 5′⁃CTTCCCAAGAAGGTTCGATTGA⁃3′（正向引物）， 5′ ⁃ TCAGACTCTCTTAGGCCAGTTAC ⁃ 3′（反向引物）；PPP2CA，5′⁃CAAAAGAATCCAACGTGCAAG⁃ AG⁃3（′ 正向引物），5′⁃CGTTCACGGTAACGAACCTT⁃ 3（′ 反向引物）。

1.2.4 蛋白免疫印迹分析

将蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液、1％ 磷酸酶抑制剂混合物加入胃癌细胞中，冰上裂解30min，提取蛋白质。使用蛋白定量试剂盒（BCA法）对各组蛋白浓度进行检测。在进行Western blot实验之前，将5×SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液按比例加入蛋白裂解物，煮沸10min后放入-20℃冰箱保存。取蛋白提取物（30~50 μg）用于预制胶电泳，电泳结束后用PVDF膜进行转膜，然后用5％脱脂奶粉溶液室温下封闭1h。TBST轻微漂洗封闭液后与稀释后的一抗（β⁃actin、PP2Acα、WTAP一抗的稀释比例均为1∶1 000）在4℃下孵育过夜，第2天与相应稀释后的二抗（二抗稀释比例为1∶10 000）在室温下孵育1h，最后在暗室中滴加适量显影液后进行曝光条带。

1.2.5 克隆形成

将稳定转染的胃癌细胞以每孔1 000个细胞的密度接种到6孔板中，并培养2~3周，弃去培养基， PBS洗涤2遍，然后将形成的细胞团用4%多聚甲醛固定15min，最后结晶紫染色20min。拍摄细胞团成像，并用Image J 1.8.0软件计数细胞团数。所有实验均一式3份进行，并重复至少3遍。

1.2.6 细胞划痕实验

配置胃癌细胞悬液，将每组细胞悬液稀释成5× 10⁵ 个/mL。将上述细胞悬液加入ibidi双孔小室中，每个小室加入70 μL细胞悬液，细胞贴壁后用无菌镊子取出小室，并加入2mL完全培养基，在0、12和24h时间点，观察细胞并使用配有照相机的倒置显微镜捕获图像。

1.2.7 细胞侵袭实验

使用24孔铺胶侵袭小室进行细胞侵袭测定，收获稳定转染胃癌细胞，并以1×10⁵ 个/mL的密度悬浮在无FBS的DMEM培养基中。接下来，将200 μL的细胞悬液加到上室中，同时将500 μL的含有10％ FBS的DMEM添加到底部小室中。于细胞培养箱中培养24h后，用棉签除去上室中未迁移的细胞，并将过滤器底部侵袭的细胞在4％的低聚甲醛中于室温固定5min。PBS洗涤后，用结晶紫染色，并在相差显微镜下在5个随机选择的视野中以×10的放大倍数（物镜）进行计数。

1.2.8 裸鼠成瘤实验

本动物实验伦理由南京医科大学实验动物中心批准（IACUC⁃2103060）。为了建立胃癌细胞的异种移植模型，从南京医科大学动物实验中心购买裸鼠（雌性，4周龄）。在注射之前，在以下标准条件下，将小鼠在无特定病原体的环境中饲养1周：光照/黑暗周期12h，温度25℃，湿度40%~60％，灭菌食物和高压蒸馏水。用100 μL的PBS重悬各组胃癌细胞（细胞数量均为5×10⁶ 个），分别皮下注射到每只小鼠的腋下（每组n=4）。4周后，对小鼠实施安乐死，并对肿瘤称重。

1.3 统计学方法

所有定量数据均表示为平均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）。使用t检验分析正态分布数据之间的统计学差异。P< 0.05为差异有统计学意义。统计分析使用的软件包括Image J 1.8.0，GraphPad Prism 8。

2 结果

2.1 PPP2CA、WTAP在胃癌组织中表达异常，二者均与胃癌预后相关

通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome At⁃ las，TCGA）数据库（https：//www.cancer.gov）比较胃癌组织及癌旁正常胃黏膜组织中的PP2Acα编码基因PPP2CA和WTAP的mRNA表达水平，发现PPP2CA在胃癌组织中明显下降（P=0.037；图1A），而WTAP在胃癌组织中显著上升（P<10^-12，图1B）。通过KM⁃plot网站（http：//kmplot.com/analysis/）进行生存率分析，结果显示PPP2CA高表达组、WTAP低表达组的预后显著优于各自的对照组（图1C、D）。以上结果表明PPP2CA在胃癌组织中表达明显下降，而WTAP在胃癌组织中却显著升高，且二者均与胃癌的预后密切相关。

2.2 抑制PP2Acα可导致WTAP的mRNA及蛋白水平升高

为了探究PP2Acα与WTAP之间的关系，通过慢病毒介导的shRNA敲减胃癌细胞BGC ⁃823中的PPP2CA，抑制PP2Acα的表达。慢病毒转染48h后，对荧光表达较强的Control组、shRNA1组、shRNA3组（图2A）进行嘌呤毒素筛选，获得了稳定低表达PP2Acα的胃癌细胞。并在mRNA及蛋白水平验证敲减成功（图2B、C）。对稳定转染的胃癌细胞进行RT⁃qPCR、Western blot实验，发现抑制PP2Acα后，胃癌细胞BGC⁃823中的WTAP的mRNA及蛋白水平均明显升高（图2B、C）。

2.3 体外实验表明抑制PP2Acα促进胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭

为了探究抑制PP2Acα对胃癌细胞的影响，在离体条件下进行了多种表型实验。抑制PP2Acα 后，胃癌细胞出现明显的上皮间充质转化（EMT）特征，即细胞形态向梭形改变，同时细胞之间变得松散 （图3A）；克隆形成实验（图3B）发现shRNA1、shRNA3组的增殖能力均较Control组明显上升（P< 0.01）。以相同的细胞密度在ibidi小室内铺板，于贴壁后的0h、12h、24h观察划痕愈合情况，发现shRNA1组、 shRNA3组的愈合能力在12h时已显著快于Control组（图3C）；且Tanswell侵袭实验也发现在培养24h后，实验组的侵袭能力明显强于对照组（P< 0.01，图3D）。上述表型实验证明了抑制PP2Acα可以促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。

2.4 在体实验表明抑制PP2Acα促进胃癌细胞的增殖

将稳定转染的胃癌细胞接种到4周龄雌性裸鼠的腋下（n=4）。4周后，处死所有裸鼠，并分离出肿瘤。结果表明，实验组肿瘤体积较对照组明显增加 （P< 0.01，图4）。裸鼠成瘤实验表明在活体层面，抑制PP2Acα可以促进胃癌细胞的增殖。

2.5 探究PP2Acα与WTAP二者之间的联系

通过蛋白互作功能富集分析网站STRING （https：//string⁃db.org/），查询PP2Acα与WTAP二者之间的联系。发现PP2Acɑ通过整合因子复合体亚基5（integrator complex subunit 5，INTS5）、RNA聚合酶Ⅱ亚基2（RNA polymerase Ⅱ subunit B，POLR2B） 与WTAP建立联系（图5A）。但是数据库显示的证据不足以明确PP2Acɑ通过INTS5、POLR2B调控WTAP的表达或功能。为了明确PP2Acɑ与WTAP之间的调控关系，又通过磷酸化位点网站Phospho⁃ site（http：//www.phosphosite.org）查询WTAP的磷酸化修饰情况，发现WTAP的氨基酸序列存在大量磷酸化位点（图5B）。这也意味着WTAP上的磷酸化修饰可能会受到PP2Acα的调控，进而影响WTAP的功能与表达。

3 讨论

PP2A全酶是由结构亚基A（65kDa），调节亚基B（50~130kDa）和催化亚基C（36kDa）组成的异源三聚体。催化亚基C为PP2A全酶的核心结构，具有2个亚型：PP2Acα（由PPP2CA基因编码）和PP2Acβ（由PPP2CB基因编码），PP2Acα的比例远高于PP2Acβ（约9倍）^[12]。因此，PP2Acα的异常表达会导致PP2A全酶活性降低，影响体内磷酸化稳态的维持，进而诱导或促进各种恶性肿瘤的发生和发展^[13]。

临床研究发现PP2Acɑ的低表达与直肠癌的T、 N、M分期相关，且PP2Acɑ低表达患者的预后更差^[14]； PP2Acɑ表达的恢复可逆转EMT，并抑制前列腺肿瘤的生长和转移^[15]；在肝癌细胞中，PP2Acɑ可以抑制P53引起的癌细胞凋亡，促进肝癌细胞的增殖^[16]。但PP2Acɑ 在胃癌中的作用却鲜有报道，通过Pubmed数据库检索，PP2Acɑ与胃癌的相关研究仅有1篇文章，2017年Huang等^[2] 发现PPP2CA的遗传变异与中国人群胃癌的患病风险相关。但胃癌恶性表型的针对性研究，并未有PP2Acɑ的相关报道，其具体机制仍需进一步研究。

WTAP作为m6A甲基转移酶复合物中的桥接蛋白，具有稳定METTL3、METTL14的作用^[17]。这一基础使得WTAP可参与细胞的许多生命过程，例如选择性剪接，X染色体失活和细胞周期调控^[18]。正因为这样，WTAP的表达失调可以促进多种恶性肿瘤的发展。例如，过表达WTAP可通过稳定周期蛋白依赖性激酶2（cyclin dependent kinase2，CDK2）转录本，进而促进肾细胞癌的进展^[19]；其也可通过Wnt/β⁃catein信号通路来增强子宫内膜癌的抗药性^[20]； 还可通过刺激转移相关标志物基质金属蛋白酶7（matrix metallopeptidase7，MMP7）和基质金属蛋白酶28（matrix metallopeptidase7，MMP28）的表达来增强胆管癌的侵袭性^[21]。所以，WTAP的表达水平与胃癌进展的关系也是值得深入研究的，但目前仅有生物信息学文章支持WTAP的高表达与胃癌进展相关，相关的基础实验仍然缺乏。

因此，本研究初步探究了PP2Acɑ失调与胃癌进展的联系，以及在这一过程中WTAP表达水平的变化。本研究中，通过慢病毒介导的shRNA抑制胃癌细胞中PP2Acɑ的表达，随后进行的细胞体外实验表明，胃癌细胞的形态出现EMT典型特征，并且增殖、迁移与侵袭能力均得到增强；裸鼠层面的活体实验，也证明了抑制PP2Acɑ可以促进胃癌细胞的增殖；RT⁃qPCR、WB实验表明，WTAP的mRNA与蛋白水平均显著升高。基于上述讨论及实验结果，推测，抑制PP2Acɑ促进胃癌细胞的恶性表型，可能是通过上调WTAP的表达水平实现的。

为了探究PP2Acɑ与WTAP之间的调控关系，笔者首先通过蛋白互作功能富集分析网站STRING，查询这两种蛋白之间的联系。发现PP2Acɑ通过INTS5、POLR2B与WTAP建立联系。但是数据库显示的证据不足以明确PP2Acɑ通过INTS5、POLR2B调控WTAP的表达或功能。为了明确PP2Acɑ与WTAP之间的调控关系，笔者又通过Phosphosite网站查询WTAP的磷酸化修饰情况，发现WTAP的氨基酸序列存在大量磷酸化位点。这表明WTAP的功能会受到磷酸化修饰的影响，而磷酸化修饰往往伴随蛋白质稳定性的改变，最终导致蛋白总量的变化。PP2Acɑ对于体内磷酸化稳态的维持必不可少，其表达失调会对蛋白的表达和功能产生重要影响，这或许可以解释本研究中出现的结果，即在胃癌细胞中抑制PP2Acɑ可导致WTAP的表达上升，但这一机制需要后续的实验深入探究加以完善。

综上，通过本研究，发现抑制PP2Acɑ可以促进胃癌的增殖、迁移与侵袭，并且在这一过程中WTAP的表达显著上调。这些结果将有助于进一步对胃癌的深入研究，并对胃癌诊疗具有重要意义。

参考文献