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人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA） 配型和新型免疫抑制剂的出现极大降低了肾移植术后急性排斥反应的发生，但是慢性移植肾失功（chronic allograft dysfunction，CAD）仍然是影响移植物存活的主要并发症之一，慢性移植肾间质纤维化形成是CAD的主要病理改变[1]。内皮细胞向间充质细胞转分化（endothelial⁃to⁃mesenchymal transition，EndMT），是内皮细胞在各种外部刺激下丢失内皮细胞的特征，转变成肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质，进而促进了病变组织的纤维化进程[2]。既往研究发现内皮细胞是肌成纤维细胞的重要来源之一，且肾微血管EndMT过程在慢性移植肾间质纤维化形成及CAD中发挥了重要作用[3]。
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目前认为，巨噬细胞可在不同刺激条件下极化成两种不同的巨噬细胞表型，一种称为经典活化M1型巨噬细胞，另一种称为替代突进活化M2型巨噬细胞[4]。研究表明巨噬细胞极化可能参与介导了慢性移植肾的损伤[5]。而另一项研究发现3个M1型巨噬细胞特异性基因（CXCL11、CCL19和CD86）可预测移植肾损伤的预后[6]。此外，在大鼠肾移植慢性排斥模型中，巨噬细胞极化过程分泌的细胞因子白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）、单核细胞趋化蛋白⁃1 （monocyte chemoattractant protein⁃1，MCP⁃1）及诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 也被发现参与了CAD的发生，并导致了慢性移植肾损伤[7]。然而，巨噬细胞极化在EndMT及CAD中的作用尚不明确。因此，本研究拟结合生物信息学分析，在组织和细胞水平探讨M1型巨噬细胞极化在EndMT过程及CAD中发挥的作用。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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1.1.1 移植肾脏组织的获取
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所有移植肾功能正常的肾脏组织（对照组）来源于2019年1月—2020年1月于南京医科大学第一附属医院行同种异体肾移植术且术后移植肾功能稳定的20例移植供肾的穿刺标本；而20例CAD的移植肾组织（CAD组）均来自于2019年1月—2020年7月于南京医科大学第一附属医院随访的移植肾功能不全患者。
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移植肾功能不全患者的纳入标准：①血清肌酐缓慢升高，病程中无明显急性排斥反应症状，血清肌酐大于200 μmol/L；②移植肾功能不全且药物干预治疗无效；③病程中无明显感染症状。
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CAD移植肾的穿刺标本的获取方式：CAD患者为行二次异体肾移植术而行失功移植肾切除捐献的病理组织标本，或因为肌酐升高及移植肾病变而行CAD肾穿刺而获取的标本。对照组和CAD患者的临床资料见表1。肾脏标本使用多聚甲醛固定，包埋后切片行染色实验。部分组织则以RNAkeeper（R501⁃ 01，南京诺唯赞公司）于-80℃保存。
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肾功能正常移植肾患者及CAD患者术前的群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）均为阴性。肾功能正常患者的移植肾组织及CAD患者肾组织标本的收集均通过南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，本研究所遵循的方案为2016⁃ SR⁃029，并且获得了所有移植受者的书面知情同意。在研究中执行的所有程序都符合国家研究委员会的道德标准，并符合1964年赫尔辛基宣言及其后来修订的道德标准。
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1.1.2 细胞与试剂
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小鼠来源的巨噬细胞Raw264.7购自上海源之信生物技术有限公司；CD68抗体（ab125212）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 抗体（ab210823）、CD31抗体（ab24590）、α⁃SMA抗体（ab124964）、Collagen Ⅰ抗体（ab260043）、VE ⁃ cadherin抗体（ab33168）、GADPH抗体（ab9485）、 Alexa Fluor® 488标记的驴抗小鼠二抗（ab150109）、 Alexa Fluor® 555标记的驴抗兔二抗（ab150062） （Abcam公司，美国）；Vimentin抗体（10366⁃1⁃AP）、 F4/80抗体（28463⁃1⁃AP）、CD206抗体（60143⁃1⁃Ig） （Proteintech公司，美国），CD206流式抗体（17⁃2061⁃ 80，Thermo Fisher Scentific公司，美国），iNOS流式抗体（130⁃116⁃421，Miltenyibiotec公司，德国）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（00 ⁃ 4976 ⁃ 93，Thermo Fisher Scentific公司，美国）、干扰素⁃γ（interferon⁃γ， IFN⁃γ）（CM41，吴江近案蛋白质科技有限公司）；引物由南京擎科生物科技有限公司设计合成。
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1.2 方法
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1.2.1 生信分析数据的获取
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本研究所使用的GSE21374数据集从GEO （Gene Expression Omnibus）公共数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）获得。包含了术后早期的穿刺移植肾标本的转录组信息，同时也包含了移植肾的存活时间与存活状态。
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1.2.2 免疫荧光染色
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石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，然后用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇梯度复水后，将玻片置入浓度为0.01mol/L、pH 6.0且已沸腾的柠檬酸钠溶液中15min，后缓慢降温至室温。接着加入3%H2O2，室温孵育15min后使用TBST洗3次，每次5min。洗完后使用免疫荧光封闭液封闭。封闭完后使用一抗（CD68抗体稀释1∶800，iNOS抗体稀释1∶1 000，CD206抗体稀释1∶200）于4℃冰箱孵育过夜；TBST洗3次，每次5min；接着使用Alexa Fluor® 488标记的驴抗小鼠二抗、Alexa Fluor® 555标记的驴抗兔二抗混合室温孵育组织1h；TBST洗3次，每次5min；使用DAPI孵育组织15min；TBST洗3次，每次5min；接着使用抗荧光淬灭剂滴上组织，使用盖玻片封片，在荧光显微镜下观察。Alexa Fluor® 488标记蛋白在荧光镜下为绿色，而Alexa Fluor® 555标记蛋白在荧光镜下为红色。
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1.2.3 HE染色与Masson染色
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HE染色玻片脱蜡复水方法同免疫荧光，将组织玻片置入苏木素液中染色5min，清水冲洗5min； 1%盐酸乙醇酸化30s，清水冲洗30s；伊红液3min，清水冲洗5min；75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇脱水，并置入二甲苯，最后用中性树脂封片。 Masson染色的玻片脱蜡、复水、苏木素染色、酸化同HE染色；接着用Masson丽春红酸性复红液处理5~10min；2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷钼酸水溶液分化3~5min后直接用苯胺蓝染5min；0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；脱水封片同HE染色。
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1.2.4 M1、M2 型巨噬细胞的诱导极化及细胞联合培养
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使用5ng/mL LPS和40ng/mL IFN ⁃ γ 诱导Raw264.7细胞，作用时间为24h，使细胞向M1型巨噬细胞方向极化。通过PCR、细胞免疫荧光及流式细胞学验证其极化效率。将2mL极化的M1型巨噬细胞按1×105 个/mL置于0.4 μm的Transwell小室上层，而小鼠主动脉内皮细胞则种植与小室下层，细胞接种密度为1 × 105 个/孔，细胞共培养条件为DMEM+10%FBS。联合培养72h后，提取下层内皮细胞的总蛋白及RNA待用。
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小鼠主动脉内皮细胞则种植于小室下层，分别在0、24、48h后向6孔板孔中加入种植了极化的M1型巨噬细胞的Transwell小室，进而获取M1型巨噬细胞作用0、24、48、72h的内皮细胞。
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选取RAW264.7巨噬细胞系，使用40ng/mL白细胞介素（interleukin，IL）⁃ 4诱导巨噬细胞系Raw264.7，作用时间为24h，使细胞向M2型巨噬细胞方向极化。通过PCR、细胞免疫荧光及流式细胞学验证其极化效率。共培养方法同前，以上实验均重复3次。
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1.2.5 聚合酶链式反应（PCR）
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所有样本的RNA通过HiScript Ⅱ合成cDNA， qRT⁃PCR则是在AB7300实时荧光定量仪（Applied Biosystems公司，美国）上进行，同时利用AA341实时定量PCR试剂行PCR反应，GADPH作为内参照检测mRNA的表达量。每个样本重复3次，通过比较Ct值进行数据分析。
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1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot，WB）
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样本使用RIPA试剂裂解抽提出蛋白质后，经测定浓度，用10%SDS⁃PAGE分离蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封闭后，将条带置于一抗 （Vimentin，1∶10 000；Collagen I，1∶1 000；GADPH， 1∶5 000；VE⁃Cadherin，1∶1 000；α⁃SMA，1∶20 000） 中，4℃孵育过夜；TBST冲洗3次，每次15min；再分别于与二抗（HRP标记的抗鼠IgG，1∶5 000；HRP标记的抗兔IgG，1∶5 000）孵育；PBST冲洗3次，每次15min；化学发光系统（Bio⁃Rad公司，美国）检测信号，并使用Image Lab软件进行分析。实验重复3次。
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1.3 统计学方法
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所有数据均利用R 3.6.1进行数据分析，用Lim⁃ ma包对公共转录组数据进行差异分析，使用Clus⁃ terprofiler包分别基于GO（Gene Ontology）和KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库行基因富集分析。同时借助生物信息学软件Ciber⁃ sort（cibersortx.stanford.edu）对各个样本的免疫细胞浸润状态进行拟合（拟合次数=100次）。利用Image J软件进行免疫荧光强度及免疫组化阳性区域的计算。所有统计图的绘制与统计均借助Graphpad软件（7.0.1）。使用Student’s t 方法比较两组间差异，多组间计量资料比较使用方差分析，还用Tukey’s多重比较检验方法比较两组之间的差异。P ＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 CAD患者移植肾中存在显著的单核巨噬细胞浸润
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首先，下载GSE21374数据集，对其进行均一化处理，并对移植肾功能稳定患者与CAD患者的转录组信息进行差异分析，发现存在大量的差异基因 （图1A）。基于GO数据库的通路富集分析结果提示，差异表达的基因主要富集于对LPS和IFN⁃γ刺激产生的反应、对病毒感染的反应、体液免疫反应、细胞外结构的重建等过程（图1B、C）；而基于KEGG数据库的通路富集分析表明，差异表达基因主要富集于免疫排斥及移植物抗宿主疾病、类风湿性关节炎、1型糖尿病等过程（图1D、E）。使用Cibersort软件对各个样本的免疫细胞成分构成进行拟合，绘制了移植肾的免疫细胞构成的柱状图 （图1F），并通过小提琴图发现CAD组的患者移植肾中存在显著的单核细胞和巨噬细胞浸润（P ＜ 0.05，图1G）。
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接着在本中心的CAD组患者移植肾组织中进行验证。HE染色显示CAD组患者移植肾中出现显著的肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化（图2A）；Masson染色提示移植肾间质出现大量胶原纤维蛋白沉积（图2B、C）。组织免疫荧光实验也发现CD68（+）iNOS（+）的M1型巨噬细胞于CAD组肾组织中浸润明显增加（P ＜0.05，图2D、E）。此外，CAD组中巨噬细胞的特异性指标CD68mRNA的表达量也显著高于对照组，而CAD组中M1型巨噬细胞的特异性指标iNOS mRNA表达量也显著高于对照组 （图2F）。上述结果提示，非特异性免疫应答参与了CAD的发生过程，且M1型巨噬细胞可能在CAD发生过程中发挥重要作用。
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2.2 体外诱导Raw264.7细胞向M1、M2巨噬细胞诱导分化
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使用5ng/mL LPS、40ng/mL IFN⁃γ诱导巨噬细胞系Raw264.7，作用24h使它向M1型巨噬细胞极化。使用40ng/mL IL⁃4诱导巨噬细胞系Raw264.7，作用24h使它向M2型巨噬细胞极化。细胞免疫荧光染色发现刺激24h后M1型Raw264.7均为F4/80 （+）iNOS（+）细胞，而M2型Raw264.7均为F4/80（+） CD206（+）细胞（图3A、B）。接着使用流式细胞学的方法，用iNOS与CD206标记Raw264.7，发现刺激24h后Raw264.7向M1极化的阳性率为93.3%，M2极化的阳性率为83.0%（图3C~E）。PCR检测发现M1型巨噬细胞的标志物（CD86、iNOS）在向M1极化的Raw264.7中表达增高，M2型巨噬细胞的标志物 （ARG1、CD206）在向M2极化的Raw264.7中表达增高（图3F）。
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2.3 M1型巨噬细胞极化诱导内皮细胞的EndMT
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体外诱导巨噬细胞向M1型极化，并将M1型巨噬细胞与内皮细胞联合培养。结果表明，随着培养时间的延长，内皮细胞的形态由铺路石样变成梭形 （图4A），而细胞免疫荧光结果提示共培养后内皮细胞CD31表达量减少，而α⁃SMA的表达量增加，提示内皮细胞发生了EndMT过程（图4B）。PCR结果表明，下层内皮细胞CD31mRNA的表达量随时间显著减少，而肌成纤维细胞的标志物（α⁃SMA、Fibro⁃ nectin、Vimentin、FSP1、Collagen Ⅰ）mRNA随时间表达增加（P ＜0.05，图4C）；WB结果表明，内皮细胞的标志物VE⁃cadherin蛋白的表达显著减少，而肌成纤维细胞的指标（α⁃SMA、Vimentin、Collagen Ⅰ）表达增加（P ＜0.05，图4D、E）。由上可见，M1型巨噬细胞极化可诱导内皮细胞发生EndMT过程。
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图1 基于GEO数据库的CAD组与移植肾功能正常组移植肾基因表达谱的生物信息学分析
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Fig.1 The bioinformatic analysis of mRNAs expression profile of the CAD allograft and normal function allograft based on the GEO database
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2.4 M1 型巨噬细胞能诱导内皮细胞的EndMT而M2型巨噬细胞不能诱导内皮细胞的EndMT
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随着培养时间的延长，和M1型巨噬细胞共培养的内皮细胞呈梭形，而和M2型巨噬细胞共培养的内皮细胞仍然保持为铺路石样（图4A）。细胞免疫荧光结果亦提示共培养后，和M2型巨噬细胞共培养的内皮细胞α⁃SMA的表达量未见增加，内皮细胞并未发生EndMT过程（图4B），M2型巨噬细胞极化不能诱导内皮细胞发生EndMT过程。结合既往研究结果，即肾微血管EndMT过程显著促进了CAD的发生，推测M1型巨噬细胞极化可能通过诱导内皮细胞发生EndMT过程而促进CAD的发生。
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图2 CAD患者移植肾组织中M1型巨噬细胞极化的检测
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Fig.2 Detection of M1macrophages in the allograft tissue of CAD patients
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3 讨论
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本研究在GEO公共数据库及本中心的移植肾标本中均发现了巨噬细胞在CAD患者移植肾组织中显著浸润；而体外实验发现，M1型巨噬细胞极化能显著诱导内皮细胞发生EndMT过程，而M2型巨噬细胞却不能诱导内皮细胞发生EndMT过程。结合本中心既往研究成果[3]，认为M1型巨噬细胞极化显著浸润于CAD移植肾组织，并可能通过诱导肾微血管EndMT过程进而促进CAD的发生。
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内皮细胞一直被认为是肌成纤维细胞的重要细胞来源之一，而EndMT被认为是上皮细胞向间充质细胞转变的一个特殊类型[8]。研究表明内皮细胞来源的肌成纤维细胞在参与肾纤维化形成的肌成纤维细胞中占比约35%[9]。而本中心既往研究发现在慢性移植肾纤维化形成及CAD过程中肾微血管EndMT过程被显著激活，且组织生长因子⁃β1参与诱导了这一过程[3，10]。同时也发现有大量的信号在慢性肾纤维化中发挥了重要作用，如Wnt/β⁃catenin信号通路、磷酸酶2A信号通路、自噬等[11-13]。既往研究都聚焦于细胞因子和信号通路导致EndMT的这一现象，较少有诱导EndMT信号因子来源的研究，同时也缺乏移植肾局部免疫微环境对EndMT影响的相关性研究。
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实体器官或组织的局部免疫微环境会导致疾病的发生与发展[14]。移植肾中同样存在局部免疫微环境，肾移植患者存在特异性免疫和非特异性免疫。已有研究发现，移植肾定植巨噬细胞的活化和移植肾的存活有关[15]；而也有研究表明骨髓来源的巨噬细胞定植于移植肾中能够转变为肌成纤维细胞，导致慢性移植肾失功的发生[16]。既往已经有大量研究表明，极化的巨噬细胞在慢性移植肾失功与损伤中的作用，比如M1型巨噬细胞的特征基因与分泌因子能够导致移植肾的慢性损伤，与患者的长期预后相关[6]。但是既往研究均局限于细胞极化状态对移植肾纤维化及预后的影响，并没有阐明极化后的巨噬细胞是通过何种途径或者机制导致了移植肾间质的纤维化。本研究发现M1型巨噬细胞能够明显诱导内皮细胞发生EndMT过程，这也部分解释了巨噬细胞极化介导移植肾纤维化的过程，同时也提示了移植肾的免疫微环境改变在移植肾间质纤维化中发挥的作用。
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图3 体外诱导Raw264.7细胞向M1、M2巨噬细胞诱导分化的鉴定结果
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Fig.3 The identification of M1and M2polarized raw264.7in vitro
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综上所述，本研究在GEO公共数据库及CAD移植肾组织中均发现了巨噬细胞明显浸润；而细胞实验证实，M1型巨噬细胞极化可显著促进内皮细胞发生EndMT。结合既往研究成果认为，M1型巨噬细胞极化可通过诱导内皮细胞发生EndMT而促进CAD的进展。
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图4 细胞共培养模型实验观察M1型与M2巨噬细胞极化对内皮细胞EndMT过程的影响
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Fig.4 The effects of M1and M2macrophage on the EndMT of endothelial cells through cells co⁃culture model
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摘要
目的：探究M1型巨噬细胞极化在内皮细胞向间充质细胞转分化（endothelium⁃to⁃myofibroblast transition，EndMT）及慢性肾移植失功（chronic allograft dysfunction，CAD）中的作用。方法：从GEO公共数据库中下载GSE21374转录组测序数据，并使用Cibersort软件分析CAD患者移植肾中的免疫细胞的浸润状态。收集本中心CAD患者的移植肾切除标本，使用免疫荧光、 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和蛋白质印迹法（Western blot，WB）等方法观察M1型巨噬细胞在移植肾组织中的浸润情况。体外脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和干扰素⁃γ（interferon⁃γ，IFN⁃γ）诱导 Raw264.7 巨噬细胞向 M1 极化。 Transwell小室构建M1型巨噬细胞和主动脉内皮细胞的共培养模型。使用PCR、WB和细胞免疫荧光观察共培养模型中内皮细胞的 CD31 与α⁃SMA 的表达情况。结果：基于 GEO 公共数据库，发现单核⁃巨噬细胞明显浸润于 CAD 移植肾组织中（P＜ 0.05）；在本中心的CAD患者移植肾标本中，CD68（+）iNOS（+）M1型巨噬细胞亦明显浸润于肾小球及间质中，且M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的mRNA表达量明显增加（P＜0.05）。在细胞共培养模型中发现，M1型巨噬细胞可明显促进内皮细胞发生EndMT过程。结论：M1型巨噬细胞明显浸润于CAD患者的移植肾组织中，并可能通过诱导内皮细胞发生EndMT促进CAD的进展。
Abstract
Objective：This study aims to explore the role of M1 ⁃ polarized macrophages in the pathogenesis of endothelial ⁃ to ⁃ mesenchymal transition（EndMT）and chronic allograft dysfunction（CAD）. Methods：The GSE21374 transcriptome array from GEO public database was downloaded，and cibersort software was used to analyze the immune cell infiltration status in allograft tissues of CAD patients. Then the allograft tissues were collected from patients diagnosed with CAD in our center. Immunofluorescence， polymerase chain reaction（PCR）and Western blot（WB）were used to observe infiltration of M1⁃ polarized macrophages in the renal allografts. Finally，in vitro lipopolysaccharide（LPS）and interferon ⁃ γ（IFN ⁃ γ）were used to induce the polarization of Raw264.7 macrophage cell line into M1 macrophages. A transwell chamber was used to establish a co⁃culture system for the M1 macrophages and Balb/c mouse⁃derived aortic endothelial cells. PCR and WB assays，as well as cell immunofluorescence，were performed to examine the expression of CD31 and α⁃SMA in the mouse⁃derived aortic endothelial cells. Results：Based on the public database，monocytes and macrophages were observed to be highly expressed in allograft tissues from CAD patients（P < 0.05）. Similarly，significant infiltration of CD68（+）iNOS（+）M1 macrophages in glomerulus and interstitial area of allograft with CAD was observed，and PCR results showed that iNOS（inducible nitric oxide synthase），the surface marker of M1 macrophages was increased significantly compared to the normal kidney tissues（P < 0.05）. Co ⁃ cultured with M1 macrophages，the EndMT of endothelial cells was promoted. Conclusion：We have observed significant M1 macrophages infiltration in the allograft tissues diagnosed with CAD，which may induce the occurrence of EndMT and CAD progression in renal transplant recipients.
关键词
巨噬细胞极化 ； 内皮细胞向间充质细胞转分化 ； 慢性移植肾失功 ； 肾脏移植