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黄褐斑是一种后天获得性、慢性发病的色素增加性皮肤病，发病机制尚不完全清楚，考虑与紫外线照射、内分泌因素、自由基损伤、炎症反应、色素代谢异常、皮肤屏障功能紊乱、皮肤血管因素、遗传易感性等多种致病因素相关。黄褐斑的治疗，现以局部治疗多见，外用药物配合激光治疗效果较肯定。大豆富含异黄酮、皂苷、多肽等生理活性物质，在抗氧化、清除自由基、预防骨质疏松及心血管疾病等方面具有重要价值[1-3]。皮肤屏障对于维持皮肤正常生理功能极为重要，但会影响外用药物透皮吸收。为了提高局部药物的吸收率，药物透皮技术应运而生。新兴透皮技术纳米微针（简称纳晶），其高晶硅纳米级针尖可穿透角质层，在表皮上建立给药通道，而不损伤真皮层，吸收效果提高10~20倍[4]。激光治疗黄褐斑是一把“双刃剑”，既要充分发挥祛除色斑优势，又要避免术后色素沉着，选择适宜的治疗参数，避免术后炎症反应，是激光治疗的关键所在[5]。大量临床研究发现，采用大光斑低能量调Q1064nm多次治疗黄褐斑效果显著[6]，可有效调节氧化应激状态，比强脉冲光临床疗效更显著[7]，是近几年广受推崇的治疗方法。
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鉴于此，本研究拟联合运用纳米微针导入大豆提取液和调Q1064nm激光的方式治疗黄褐斑豚鼠模型，对其治疗前、后进行实验观察，评估治疗效果，为黄褐斑治疗提供新的思路和方法。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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成年雌性豚鼠，60只，清洁级，体重320~380g。购于北京海淀区兴隆实验动物养殖场，许可证号： SCXK（京）2016⁃0003。
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SH2B紫外线光疗仪（上海希格玛公司），黄体酮注射液（浙江仙琚制药），大豆提取液（内蒙古医科大学基础实验室制备，采用低温萃取法获得的液体，需低温保存），Q开关1064nm（Nd：YAG）激光治疗机（吉林科英），纳米晶片促渗仪（苏州纳通生物），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程），黑色素瘤鼠单克隆抗体Melan A（北京博奥森），Olympus光学显微镜（Olympus公司，日本）， CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统（空总医院与北航大学共同研制）。
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1.2 方法
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1.2.1 实验动物分组
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60只豚鼠随机抽取12只，作为A组（空白对照组），不造模，不治疗；剩余48只为B组（模型制备组）。造模45d，随机分为4组：分别为B1组（模型对照组）不治疗；B2组（激光治疗组）相同参数激光治疗，每周1次，治疗5次；B3组（大豆治疗组）纳晶促渗仪导入大豆提取液，每日1次，治疗5周；B4组 （大豆联合激光组）两种方式联合治疗。
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1.2.2 黄褐斑豚鼠模型制备
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脱毛采用上蜡法[8]，豚鼠背部脱毛范围约4cm× 4cm。采用“紫外线照射法[7] ”+“黄体酮冲击法[9] ” 制备模型，豚鼠置于固定笼内，与光源的距离为20cm，连接电源打开SH2B紫外线光疗仪，每日照射1次，每次30min，连续45d。黄体酮注射液配置成安全剂量2mL/kg，豚鼠后肢消毒后肌肉注射，每日1次，双后肢交替注射，连续45d。
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1.2.3 模型治疗
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调Q1064nm激光：波长1 064nm，光斑8mm，能量密度1~2J/cm2[10-11]，助手固定好豚鼠治疗区域，在治疗区域从左至右均匀扫描2遍，光斑重叠不超过10%，皮肤轻微发红停止治疗，每周1次，治疗5次，每次约1min。
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纳米微针导入方法：清洁豚鼠治疗区域，纳米晶片安装在纳晶促渗仪头部，将大豆提取液（20mg/mL） 垂直滴于纳米晶片上，开启电源，在治疗区域从左至右平行滑动且垂直按摩2遍，每日1次，治疗5周。
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1.2.4 取材
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在造模后（治疗前）、治疗1周即刻、治疗5周即刻、治疗结束3周取材。取材前1d脱毛，豚鼠腹腔注射10%水合氯醛水溶液（安全剂量0.3mL/100g [12-14]），麻醉15min后，助手固定好豚鼠，用无菌手术器械迅速在皮损处取适量的皮肤组织。
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1.2.5 各项指标观测
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表观指标：观察豚鼠背部实验区域皮肤的变化，如色斑颜色深浅、面积大小、毛发光泽度。
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皮肤CT：取材前用皮肤CT逐层扫描治疗区域皮肤，观察表、真皮变化，特别是表皮黑素细胞（melano⁃ cyte，MC）、黑素颗粒等。
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皮肤SOD活性、MDA水平的测定：豚鼠背部皮肤取约5mg组织，用4℃生理盐水冲洗，滤纸吸去水分，组织切碎待用。按说明书配制实验试剂，分别用羟胺法及硫代巴比妥酸测定。
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免疫组化检测Melan A：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复阻断内源性过氧化氢酶，一抗Melan A抗体4℃过夜孵育，二抗山羊抗兔IgG抗体室温孵育， DAB显色，苏木素复染，不同浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。
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MC相关数据：显微镜物镜下，每张片随机选择不同视野，用病理图像分析系统对黑素阳性目标图像采集、存储、定量分析，记录各组不同时期MC阳性目标数量。
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1.3 统计学方法
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使用SPSS22.0对各组数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（ ± s）表示，经检验均符合正态分布，采用方差分析进行比较，组间比较采用LSD⁃t 检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 各组表观指标变化
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造模后B1、B2、B3、B4组背部造模区域出现不规则形的黑褐色斑片，与A组对比鲜明，提示造模成功。A组、B1组在治疗前、治疗1周即刻、治疗5周即刻、治疗结束3周未见明显变化。
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治疗后B4组色斑基本消退，B4组治疗区域近似于A组背部皮肤，疗效明显，B2、B3组可见散在分布色斑，颜色较前变浅。各组治疗结束3周均未出现色沉及复发（图1）。
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2.2 各组皮肤CT结果
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与B1组相比，B4组的MC和黑素颗粒显著减少，B2、B3组的MC和黑素颗粒也减少。治疗结束后，B2、B3、B4组豚鼠的表皮较治疗前变薄，颗粒层含少量黑素颗粒，基底层黑素含量显著降低，可见散在分布的MC，黑素颗粒显著减少，偶可见树枝状细胞，真皮浅层可见少许黑素颗粒（图2）。
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2.3 各组皮肤SOD活力、MDA含量的变化
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B2、B3、B4组治疗前、后，SOD活力及MDA含量均有差异（P ＜0.05），说明3组治疗方法均有疗效。通过方差分析，两两组间比较均有差异（P ＜0.05）， B4组联合治疗疗效最显著（表1、2）。
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2.4 各组Melan A免疫组化结果
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B1组镜下可见阳性MC、黑素颗粒较多，呈强阳性反应；基底细胞层可见分布密集的阳性MC，MC胞体及胞核较大，伴核上移；基底细胞层以上可见大量呈线状或带状致密的黑素颗粒，着色较深。B2、B3组镜下可见阳性MC、黑素颗粒减少；基底细胞层偶可见少量棕黄色MC；基底细胞层以上偶可见少量的黑素颗粒。B4组镜下可见阳性MC、黑素颗粒数量显著减少，基底细胞层偶可见少量呈棕黄色MC和极少量的黑素颗粒（图3）。
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图1 各治疗组不同时期皮肤表现
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2.5 各组MC阳性目标数量比较
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治疗5周即刻，B2、B3、B4组与治疗前相比，MC阳性目标数量都显著下降（P ＜0.05）。B4组MC阳性目标数量变化最显著，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），因此B4组治疗效果最佳（表3）。
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3 讨论
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MC起源于神经嵴，是合成和分泌黑素的树枝状细胞。多项研究表明，黄褐斑病变区与周围正常皮肤相比，组织学特征为表皮变薄、表皮突变平，MC增大，且树突明显突出，MC功能活跃，黑素合成增加，基底层黑素显著增多，真皮浅层偶有游离黑素颗粒和噬黑素细胞，但MC数量有无变化尚不明确[15-17]。长期反复紫外线照射，能引起MC增殖和功能活跃，产生更多的黑素导致色素沉着[18-20]。雌激素和黄体酮增多刺激MC致色斑形成。研究表明，豚鼠表皮内MC和黑素小体分布与人体相似，若暴露紫外线下也有类似人体的色沉反应[21]。
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图2 各治疗组不同时期皮肤CT表现
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与治疗前比较，* P< 0.05；与A组比较，# P< 0.05；与B1组比较，△P< 0.05。
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皮肤CT对黄褐斑的诊疗具有重要意义。检测优势包括：进行无创分型，根据镜下MC形态判断是否处于活跃期，从而指导治疗方法的选择。造模后皮肤CT镜下角化过度、棘层肥厚、基底层较多的MC呈簇状分布，黑素颗粒明显增多，弥漫分布呈强折光性粗大颗粒，形似“繁星点点”，也可见树枝状增殖活跃MC。真皮浅层可见少许黑素颗粒沉积，周围偶可见不规则性的噬黑素细胞。与A组相比，造模后豚鼠基底层黑素含量显著增加，MC活跃，符合黄褐斑皮肤CT镜下特点，提示黄褐斑豚鼠模型造模成功。
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与治疗前比较，* P< 0.05；与A组比较，# P< 0.05；与B1组比较，△P< 0.05。
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图3 各治疗组不同时期皮肤Melan A免疫组化镜下表现（×400）
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抗氧化剂是治疗黄褐斑的重要措施。本研究发现，与模型对照组相比，大豆治疗组皮损得到改善，皮肤中SOD活力显著升高，MDA含量显著降低， MC阳性目标数量降低，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），说明大豆提取液具有抗自由基作用，可以清除ROS，减轻紫外线损伤，修复受损细胞，抑制酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性，减少黑素形成等作用，与既往研究结果一致，但具体机制还有待进一步研究。配合纳米微针可以达到很好的渗透作用，单一治疗与联合治疗相比，效果欠佳，起效慢，需要长期外用，抑制MC活性、降低黑素形成的针对性不强。
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本研究发现，造模后镜下可见基底细胞层MC及黑素颗粒较多，呈强阳性反应，联合治疗后，基底细胞层MC及黑素颗粒数量显著减少；通过病理图像软件定量分析，联合治疗后与治疗前相比，MC阳性目标数量明显降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。说明联合治疗效果优于单一治疗。
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与治疗前比较，* P< 0.05；与A组比较，# P< 0.05；与B1组比较，△P< 0.05。
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调Q1064nm激光采用光爆破原理，靶组织选择性吸收激光后，将光能转化为热能，迅速膨胀碎裂，细小颗粒可被巨噬细胞吞噬、吸收。高能量激光治疗黄褐斑易出现炎症后色沉、水疱等不良反应[21-24]。本研究采用低能量激光，尽量避免术后不良反应，但同时色斑短期内并不容易被祛除，需要多次治疗逐渐达到治疗效果。黄褐斑易复发，单一激光治疗虽具有一定疗效，但复发率较高被多项研究证实[25]。因此，需要联合治疗提高患者满意度。
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黄褐斑病程顽固，影响容貌美观，临床治疗的重点是在保证临床有效性的基础上，控制不良反应与复发。联合治疗后，MC阳性目标数量显著下降，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。本研究发现联合治疗较单一治疗效果更佳，为联合治疗提供动物实验依据。
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摘要
目的：观察纳米微针导入大豆提取液联合调Q1064 nm激光治疗黄褐斑豚鼠模型后对表皮黑素细胞（melanocyte， MC）的影响，为联合治疗提供动物实验依据。方法：60只豚鼠随机抽取12只为A组（空白对照组），剩余豚鼠为B组（模型制备组），造模45 d后分为B1（模型对照组）、B2（激光治疗组）、B3（大豆治疗组）、B4（大豆联合激光组），在治疗不同时期比较各组皮肤表观指标、皮肤CT、皮肤超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，免疫组化检测Melan A变化，观察对表皮MC的影响。结果：①造模后，B1、B2、B3、B4组与A组相比，MC阳性目标数量显著增高（P＜ 0.05），豚鼠黄褐斑模型制备成功。②B2、B3、B4组治疗前、后SOD活力及MDA含量差异均有统计学意义（P＜0.05），B4组差异最显著（P＜0.05）。③治疗5周即刻起，B2、B3、B4组与治疗前相比，MC阳性目标数量显著下降（P＜0.05），B4组差异最显著 （P＜0.05）。结论：调Q1064 nm激光联合纳米微针导入大豆提取液治疗黄褐斑较单独治疗效果更佳。
关键词
调Q1064 nm激光 ； 纳米微针 ； 大豆提取液 ； 黄褐斑豚鼠模型 ； 黑素细胞