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利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

  • 陈红全1,2

    机 构：

    1. 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科,浙江 杭州 310016

    2. 南京医科大学生殖医学国家重点实验室,江苏 南京 211166

    ×
  • ，王建瑛2

    机 构：

    2. 南京医科大学生殖医学国家重点实验室,江苏 南京 211166

    ×

1. 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科,浙江 杭州 310016；
2. 南京医科大学生殖医学国家重点实验室,江苏 南京 211166；

Screening of cisplatin resistance genes in HeLa cell line with inducible expression of Cas9

  • CHEN Hongquan1,2

    Affiliation：

    1. Clinical Laboratory,Sir Runrun Shaw Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310016

    2. State Key Laboratory of Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 211166 ,China

    ×
  • ，WANG Jianying2

    Affiliation：

    2. State Key Laboratory of Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 211166 ,China

    ×

1. Clinical Laboratory,Sir Runrun Shaw Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310016；
2. State Key Laboratory of Reproductive Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 211166 ,China；

通讯作者:

王建瑛,E⁃mail:wangjianying@njmu.edu.cn

中图分类号:R730.5

文献标识码:A

文章编号:1007-4368(2021)10-1432-09

DOI:10.7655/NYDXBNS20211002

参考文献 1
VASAN N，BASELGA J，HYMAN D M.A view on drug resistance in cancer［J］.Nature，2019，575（7782）：299-309
查找原文
参考文献 2
SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al.Ge⁃ nome ⁃ scale CRISPR ⁃Cas9 knockout screening in human cells［J］.Science，2014，343（6166）：84-87
查找原文
参考文献 3
MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interfer⁃ ence：RNA⁃directed adaptive immunity in bacteria and ar⁃ chaea［J］.Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190
查找原文
参考文献 4
JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A program⁃ mable dual ⁃RNA ⁃guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］.Science，2012，337（696）：816-821
查找原文
参考文献 5
GJ K，DOUDNA J A.CRISPR⁃Cas guides the future of ge⁃ netic engineering［J］.Science，2018，361（645）：866-869
查找原文
参考文献 6
KIM S，KIM D，CHO S W，et al.Highly efficient RNA ⁃ guided genome editing in human cells via delivery of puri⁃ fied Cas9 ribonucleoproteins［J］.Genome Res，2014，24（6）：1012-1019
查找原文
参考文献 7
SHEN B，ZHANG W，ZHANG J，et al.Efficient genome modification by CRISPR ⁃Cas9 nickase with minimal off ⁃ target effects［J］.Nat Methods，2014，11（4）：399-402
查找原文
参考文献 8
WANG W，YANG J，LIU H，et al.Rapid and efficient re⁃ programming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（45）：18283-18288
查找原文
参考文献 9
CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engi⁃ neering using CRISPR/Cas systems［J］.Science，2013，339（6121）：819-823
查找原文
参考文献 10
SHEN B，ZHANG J，WU H，et al.Generation of gene⁃mod⁃ ified mice via Cas9/RNA ⁃ mediated gene targeting［J］.Cell Res，2013，23（5）：720-723
查找原文
参考文献 11
HWANG W Y，FU Y，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR ⁃Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31（3）：227-229
查找原文
参考文献 12
MALI P，YANG L H，ESVELT K M，et al.RNA ⁃ guided human genome engineering via Cas9［J］.Science，2013，339（6121）：823-826
查找原文
参考文献 13
TAN R，DU W，LIU Y，et al.Nucleolus localization of spy⁃ Cas9 affects its stability and interferes with host protein translation in mammalian cells［J］.Genes Dis，2020，doi：10.1016/j.gendis.2020.09.003
查找原文
参考文献 14
ZHAO L，ZHOU S，GUSTAFSSON J.Nuclear receptors：recent drug discovery for cancer therapies［J］.Endocr Rev，2019，40（5）：1207-1249
查找原文
参考文献 15
MARINO M，DISTEFANO E，TRENTALANCE A，et al.Estradiol ⁃ induced IP（3）mediates the estrogen receptor activity expressed in human cells［J］.Mol Cell Endocri⁃ nol，2001，182（1）：19-26
查找原文
参考文献 16
YUSA K，RAD R，TAKEDA J，et al.Generation of trans⁃ gene⁃free induced pluripotent mouse stem cells by the pig⁃ gyBac transposon［J］.Nat Methods，2009，6（5）：363-369
查找原文
参考文献 17
FU Y F，SANDER J D，REYON D，et al.Improving CRIS⁃ PR ⁃Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs ［J］.Nat Biotechnol，2014，32（3）：279-284
查找原文
参考文献 18
SCHMID⁃BURGK J L，GAO L，LI D，et al.Highly paral⁃ lel profiling of Cas9 variant specificity［J］.Mol Cell，2020，78（4）：794-800
查找原文
参考文献 19
SLAYMAKER I M，GAO L，ZETSCHE B，et al.Rational⁃ ly engineered Cas9 nucleases with improved specificity ［J］.Science，2016，351（6268）：84-88
查找原文
参考文献 20
KLEINSTIVER B P，PATTANAYAK V，PREW M S，et al.High⁃fidelity CRISPR⁃Cas9 nucleases with no detect⁃ able genome⁃wide off⁃target effects［J］.Nature，2016，529（7587）：490-495
查找原文
参考文献 21
CHEN J S，DAGDAS Y S，KLEINSTIVER B P，et al.En⁃ hanced proofreading governs CRISPR ⁃Cas9 targeting ac⁃ curacy［J］.Nature，2017，550（7676）：407-410
查找原文
参考文献 22
HU J H，MILLER S M，GEURTS M H，et al.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity［J］.Nature，2018，556（7699）：57-63
查找原文
参考文献 23
LEE J K，JEONG E，LEE J，et al.Directed evolution of CRISPR ⁃ Cas9 to increase its specificity［J］.Nat Com⁃ mun，2018，9（1）：3048
查找原文
参考文献 24
RAN F A，CONG L，YAN W X，et al.In vivo genome edit⁃ ing using Staphylococcus aureus Cas9［J］.Nature，2015，520（7546）：186-191
查找原文
参考文献 25
ZETSCHE B，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al.Cpf1 is a single RNA⁃guided endonuclease of a class 2 CRISPR⁃Cas system［J］.Cell，2015，163（3）：759-771
查找原文
目录contents

    摘要

    目的：利用PiggyBac转座子系统，构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，并针对人核受体基因构建sgRNA文库，进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体，与PB⁃CAG⁃rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中，通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系；构建核受体基因sgRNA病毒文库，并感染可诱导表达Cas9的HeLa 细胞系，筛选对顺铂具有抵抗性的克隆，并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株，在5 个基因位点上可以进行高效编辑；感染sgRNA文库之后，挑选顺铂耐药的克隆，并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA，经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统，构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑，并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。

    Abstract

    Objective：Taking advantage of the PiggyBac transposon system to generate a stable HeLa cell line that can inducibly express Cas9，and to construct a sgRNA library for human nuclear receptor genes to screen for cisplatin resistance genes. Methods：PB ⁃ TRE ⁃ Cas9 ⁃ NLS ⁃ IRES ⁃ hrGFP ⁃ Zeo vector was constructed and transferred into HeLa cells together with PB ⁃ CAG ⁃ rtTA and the transposase vectors. Stable cell lines were obtained by drug screening and picking up single clones. Constructed the sgRNA virus library targeting nuclear receptor genes to infect the stable cell line，screened the clones resistant to cisplatin，and carried out the sequencing and identification of the target genes. Results：Five gene loci were edited efficiently in the stable cell line. Clones resistant to cisplatin were obtained after infection of sgRNA library，and most clones harbored VDR sgRNA and mutant VDR gene. Conclusion： Using PiggyBac transposon system，stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9 was successfully constructed. The cell line can be used for efficient gene editing at multiple sites and high⁃throughput library screening for cisplatin resistance genes.

  • 耐药性仍然是治愈癌症的主要限制因素，尽管多种化疗药物早期对肿瘤的治疗效果很好，但随着耐药性的产生，常导致癌症复发[1]，对肿瘤细胞耐药机制的研究有助于更好地治疗癌症。RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）曾被应用于肿瘤细胞耐药基因的筛选，但由于RNAi不能完全抑制基因表达，而且存在广泛的脱靶效应，影响对基因功能的判定。CRISPR ⁃Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系统具有高效、便捷等诸多优点，为肿瘤细胞耐药性分子机制的解析提供了强大的工具[2]。

  • CRISPR⁃Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的免疫防御系统，用以对抗入侵的病毒及外源核酸[3]。目前，对Ⅱ类CRISPR⁃Cas系统中来源于酿脓链球菌的 Streptococcus pyogenes Cas9（sp⁃ Cas9）研究最为深入，Cas9蛋白作为核酸内切酶，在引导RNA的指导下识别目标DNA序列后激活Cas9蛋白的酶切活性[4]。正是由于这种靶向功能，CRIS⁃ PR/Cas9系统已被广泛应用于多物种的基因编辑、基因调控、定位成像、细胞谱系追踪、高通量文库筛选以及病毒检测等领域[5]。目前该系统还存在诸多缺点，如Cas9表达载体过大，不容易被转染进细胞； Cas9载体长时间表达，会增加脱靶的风险[6]。因此，有必要构建一个可诱导表达Cas9的稳定细胞系，用以解决低效转染和因Cas9长时间表达而导致高脱靶风险的问题。

  • 慢病毒常被用于稳定细胞系的构建，但是需要包装病毒颗粒，费时费力，并存在感染的风险，本研究利用便捷的PiggyBac转座子系统，成功构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，并证明在多个位点可以高效切割基因组；同时，我们针对人核受体基因，设计了对应的sgRNA文库，在这个细胞系上进行了抗癌药物顺铂（Cisplatin）耐药性的筛选，以期为顺铂耐药机制的解析打下基础。

  • 1 材料和方法

  • 1.1 材料

  • HEK293T和HeLa细胞购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖DMEM（HyClone公司，美国），胎牛血清（FBS）（Gem⁃ ini公司，美国），青链霉素（Gibco公司，美国）；Lipo⁃ fectamine2000（Invitrogen公司，美国）；强力霉素 （Sigma公司，美国）；Zeocin（Invitrogen公司，美国）； 嘌呤霉素（Merck公司，德国）；高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa公司，日本）；限制性内切酶Bsa Ⅰ（NEB公司，美国）；Esp3 Ⅰ（Fermentas公司，立陶宛）；多聚赖氨酸（Sigma公司，美国）； T7EN1（NEB公司，美国）；T载体（TaKaRa公司，日本）。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 质粒构建

  • pST1374 ⁃NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9、pST1374 ⁃NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9⁃NLS、pST1374⁃NLS ⁃ Flag ⁃Cas9⁃NP、pST1374⁃ Cas9⁃NLS和pST1374⁃Cas9⁃SP改自pST1374⁃NLS ⁃ flag⁃linker⁃Cas9（Addgene公司，美国）[7]。用于构建针对人RAG1基因的sgRNA表达载体通过寡聚核苷酸（oligo）在体外退火，利用Bsa Ⅰ位点插入pGL3⁃ U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro载体（Addgene公司，美国）[7]，所用oligo序列为hRag1 ⁃U6 ⁃Up：5′ ⁃ CCGGTGTCT⁃ GCTTTGATGGACA⁃3′；hRag1⁃U6⁃Down：5′⁃AAACT⁃ GTCCATCAAAGCAGACA⁃3′。

  • 用于高通量构建sgRNA的表达载体pGL3⁃U6⁃ ccdB⁃PGK⁃Puro改自pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro载体。以pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro为模板，利用前向特异引物和共用反向引物扩增出19N ⁃ sgRNA backbone，通过 Esp3Ⅰ酶切位点，插入pGL3 ⁃U6 ⁃ ccdB⁃PGK⁃Puro载体。用于构建sgRNA文库的慢病毒载体pLKO.1⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro改自pGL3⁃U6⁃ ccdB⁃PGK⁃Puro。

  • 针对47个核受体基因各设计2条sgRNA（表1）。共用的反向引物为T7gRNA Esp3I Rev：5′ ⁃ TTA⁃ CACCGTCTCGTTTATGCTTCCGGCTCGTATG⁃3′。

  • PiggyBac转座子系统由刘澎涛教授惠赠[8]。 NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9 ⁃ NLS和Cas9 ⁃ NLS片段分别来自pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS和pST1374⁃Cas9⁃NLS， IRES⁃hrGFP片段扩增自pShuttle⁃IRES⁃hrGFP（Agi⁃ lent Technologies公司，美国），Sv40Pro⁃BleoR⁃pA片段扩增自pcDNA3.1⁃Zeo载体，以上片段通过酶切位点克隆至PiggyBac表达载体中，构建PB⁃TRE⁃NLS⁃ Flag ⁃Cas9⁃NLS ⁃ IRES ⁃hrGFP ⁃Zeo和PB ⁃TRE ⁃Cas9⁃ NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体。

  • 1.2.2 细胞培养和转染

  • HEK293T和HeLa细胞培养于高糖DMEM， 10%FBS，1%100×青链霉素中。

  • HEK293T细胞利用Lipofectamine2000进行转染。在12孔板中，1 μg Cas9各载体和0.5 μg sgRNA载体被共转染到HEK293T中，72h之后收集细胞用于下游分析。在24孔板中，0.5 μg PB ⁃TRE ⁃NLS ⁃ Flag⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo和0.25 μg PB⁃CAG⁃ rtTA载体被共转染到HEK293T中，24h之后加入强力霉素（Dox）至2 μg/mL，72h之后用于表达分析。

  • HeLa细胞利用电转（BioRad Gene Pulser XL）转染。4 μg PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo、2 μg PB⁃CAG⁃rtTA和2 μg转座酶载体被共电转到2×106 个HeLa细胞中，48h之后，加入100 μg/mL Zeocin筛选3代，然后用于单克隆的生长和挑选。对于挑出来的稳定表达可诱导Cas9的细胞株，电转2 μg sgRNA表达载体，24h后加入Dox（2 μg/mL）和嘌呤霉素（1 μg/mL），72h后收集细胞并提取DNA。

  • 表1 构建sgRNA表达载体所用引物

  • Table1 Sequences of primers for constructing sgRNA expression vectors

  • （续表1）

  • HeLa8E克隆细胞经扩增后加入Dox，以诱导Cas9的表达和对目标基因的编辑。分别加入0.3、 0.9、1.5 μg/mL顺铂处理细胞48h，在对照细胞（未加Dox）全部死亡之后，撤掉顺铂。由于0.3 μg/mL的顺铂不能使对照细胞全部死亡，后续实验从0.9 μg/mL和1.5 μg/mL两组中挑选单克隆进行。

  • 1.2.3 免疫荧光染色

  • HEK293T细胞培养在包被了多聚赖氨酸的盖玻片上，转染72h之后，细胞直接用于拍照，或者用4%的PFA（paraformaldehyde）室温固定15min，PBS洗2次，用含0.2%Triton 100的PBS处理5min以增加细胞膜的渗透性，然后用标准羊血清（武汉博士德公司）室温封闭30min。用加抗⁃Flag M2（Sigma公司，美国）的封闭液室温孵育2h。PBS洗2次后，将cy3⁃conjugated⁃goat⁃抗⁃mouse IgG（Jackson Immuno⁃ Research公司，美国）二抗和Hoechst 33258（Sigma公司，美国）加入PBS，并室温孵育细胞1h，PBS洗3次后用Vectashield Mounting medium（Vector Laborato⁃ ries公司，日本）进行封片。所有免疫荧光图片用Olympus Flueview 1000激光共聚焦显微镜拍摄。

  • 1.2.4 T7EN1切割检测

  • 收集的细胞用裂解液（10 μmol/L Tris⁃HCl， 0.4mol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%SDS，100 μg/mL Proteinase K）在58℃水浴锅中消化过夜，用酚氯仿抽提裂解物，然后用乙醇沉淀得到DNA。目的DNA片段通过PCR从基因组中扩增出，PCR产物用PCR cleanup kit（Axygen公司，美国）纯化，吸取200ng纯化后的PCR产物，在20 μL的1×NEBuffer 2（NEB公司，美国）体系中退火，退火程序为95℃ 5min；95℃~85℃，每秒降低1℃；85℃~25℃，每秒降0.1℃；4℃保持。退火后的PCR产物用0.5 μL T7EN1在37℃ 水浴锅中处理30min，然后在2.5%的琼脂糖凝胶中电泳。利用Image J软件对凝胶电泳图片进行光密度定量分析，采用之前报道的公式计算切割效率[9]，公式如下： 切割效率 =1-1-a+ba+b+c×100。a、b代表被切割片段的光密度值，c代表未被切割片段的光密度值，对于需要TA克隆和测序的样品，PCR产物克隆进T载体，挑取阳性克隆用M13⁃47通用引物测序。

  • PCR扩增引物hRAG1⁃For：5′⁃GTGAAAGCCAT⁃ CACAGGGAGAC⁃3′，hRAG1⁃Rev：5′⁃AGAATGCCT⁃ CCCAGCTCAAGC ⁃ 3′，扩增产物大小为623bp； hERb lib⁃testF：5′⁃CTTCCTCCTACAACTGCAGTCAA⁃ 3′，hERb lib⁃testR：5′⁃CGCAATCGTGCCATTATACT⁃ CCA⁃3′，扩增产物大小为656bp；hERRa lib⁃testF：5′⁃ GCATTGAGCCTCTCTACATCAAG⁃3′，hERRa lib⁃tes⁃ tR：5′⁃GGTACCCTGAACTCACTCACATC⁃3′，扩增产物大小为522bp；hERRb lib ⁃testF：5′ ⁃GACTTCCC⁃ GATTTGTGTCCACAG ⁃ 3′，hERRb lib ⁃testR：5′ ⁃CT⁃ GTCCAGTGCCAGAATGAGAAG⁃3′，扩增产物大小为609bp；hERRg lib⁃testF：5′⁃CACTACAGGACAGAC⁃ GCTTCATT ⁃3′，hERRg lib ⁃testR：5′ ⁃CTCGTTAGCT⁃ TACACTGGCAGTA⁃3′，扩增产物大小为684bp。

  • 1.2.5 顺铂耐药克隆sgRNA序列测定和目标基因验证

  • 顺铂耐药克隆sgRNA序列扩增引物为pGL3to PLKO Cla1For：5′ ⁃CTCGACGGTATCGATCACGAG ⁃ AC⁃3′，U6array seq Rev⁃new：5′⁃CTGCCATTTGTCT⁃ CGAGGTCGAG ⁃3′，扩增产物大小为549bp，利用pGL3to PLKO Cla1For引物进行测序。VDR基因编辑位点扩增引物为hVDR lib⁃testF：5′⁃GCTGAAG⁃ CAGGAGGATTACTTGA⁃3′，hVDR lib⁃testR：5′⁃GA⁃ CACCAACACACAGATCCTCAA⁃3′，扩增产物大小为717bp，利用hVDR lib⁃testF引物进行测序。

  • 1.3 统计学方法

  • 实验数据利用GraphPad Prism 7.0统计分析，数据以均数±标准差（x- ± s）表示，采用单因素方差分析，使用Tukey检验进行两组比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 可诱导表达Cas9载体的构建和验证

  • 来自不同实验室的Cas9载体各不相同，有的NLS放置在Cas9的一端[10-11]，有的放置在两端[9]，有的利用了不同的NLS序列[9，11]，密码子优化的规则也各不相同[9-12]。我们将不同版本的Cas9和PGL3⁃ U6⁃Rag1⁃sgRNA转染HEK293T细胞，利用T7EN1酶切来检测不同版本Cas9的切割效率。结果显示， NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS和Cas9⁃NLS具有相对较高的切割效率，光密度定量分析也得出一致的结果，但不同Cas9版本之间的切割效率差异无统计学意义（图1A、B）。我们选择NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS和Cas9⁃NLS这2个版本的Cas9进行PiggyBac转座子载体的构建，通过连接IRES⁃hrGFP来指示Cas9的表达情况，通过连接BleoR抗性基因，利用Zeocin药筛来获得稳定插入Cas9的细胞（图1C）。在瞬时共转染PB⁃ TRE ⁃ NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9 ⁃ NLS和PB ⁃ CAG ⁃ rtTA的HEK293T细胞中加入Dox，可以成功诱导hrGFP的表达，而未加入Dox的对照组中未见阳性信号（图1D）。为了进一步检测Cas9是否表达，我们利用an⁃ ti⁃Flag抗体进行染色，结果显示GFP阳性的细胞，同时也是Flag阳性的，并且Flag信号定位在细胞核中 （图1E），说明Cas9蛋白成功表达和定位。有趣的是，Flag染色结果显示Cas9蛋白在核仁中富集，这和之前报道的现象一致[7]，最近的研究表明，Cas9含有核仁定位信号，突变核仁定位信号会导致Cas9蛋白均匀分布在细胞核中，但是其切割效率也会随之降低[13]。

  • 2.2 可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证

  • 为了提高转座效率，我们使用插入片段较小的PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体构建可诱导表达Cas9的稳定细胞系。PiggyBac转座子载体、 PB⁃CAG⁃rtTA和转座酶载体共电转，加入Zeocin传代3次之后，挑选圆形的单克隆接种到96孔细胞板中继续培养，加入Dox之后，在荧光显微镜下挑选GFP阳性的克隆，共挑出7个GFP信号较强的克隆 （1A、1G、2B、3G、5H、8E、10A）继续培养（图2A）。为了挑选效率最高的细胞系，我们在这7个细胞株中电转了PGL3⁃U6⁃Rag1⁃sgRNA，PCR扩增目的片段并进行T7EN1酶切，结果显示8E克隆具有较高的切割效果（图2A）。为了进一步检测切割效率，我们将PCR产物进行了TA克隆并测序，在17个成功测序克隆中检测到15个克隆含有突变，效率高达88.2%（15/17），其中76.5%（13/17）的克隆发生了碱基缺失，11.8%（2/17）的克隆同时发生了缺失和插入（图2B），这些结果说明我们成功构建了可诱导表达Cas9的稳定细胞系。

  • 图1 可诱导表达Cas9载体的构建和验证

  • Fig.1 Construction and verification of inducible Cas9expression vector

  • 图2 可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证

  • Fig.2 Generation and verification of a stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9

  • 为了检测HeLa8E细胞株在其他基因位点的基因编辑效果，我们针对人ERb、ERRa、ERRb和ERRg4个基因设计相应的sgRNA，并检测切割效率。传统的sgRNA表达载体构建依赖oligo的退火然后连接到载体中，无法进行sgRNA表达载体的高通量构建，为了能在HeLa8E细胞上进行高通量筛选，我们将sgRNA识别序列设计在前向引物上，以sgRNA的骨架为模板，和公共后向引物扩增出携带完整sgRNA序列的片段，利用二类限制性内切酶Esp3Ⅰ 和T4DNA连接酶，通过边切边连的方式，可以高通量地构建sgRNA表达载体（图2C）。我们利用这种方法一次性构建了8条sgRNA表达载体，针对每个基因，等质量混合2条sgRNA载体，并电转HeLa8E细胞系，PCR扩增结果显示每个基因都出现了明显的片段缺失（图2D）。以上结果证明我们构建的可诱导表达Cas9的稳定细胞系没有编辑位点的偏好性，可以在多个基因位点进行高效基因编辑，为下一步用于高通量sgRNA文库筛选打下了很好的基础。

  • 2.3 顺铂耐药性核受体基因的筛选

  • 顺铂是一种含铂的抗癌药物，对恶性上皮肿瘤、淋巴瘤等都有治疗功效，长期使用这种药物会导致人体产生耐药性，但是耐药机制仍存在争议[1]。核受体超家族是配体激活的转录因子，共含有48个基因，在细胞分化、增殖和代谢中发挥不同作用，参与多种癌症的发生、发展[14]。核受体是重要的药物靶点，阻断乳腺癌患者雌激素受体（ERa）作用的药物或阻断前列腺癌患者雄激素受体（AR）作用的药物显著改善了患者的生存，但也伴随着严重的药物耐药性[14]。为了探究核受体超家族成员是否参与顺铂耐药性的发生，我们针对目前鉴定的47个人类核受体基因（由于HeLa细胞不表达ERa[15]，所以排除此基因），设计了94条sgRNA，组成了一个小型的sgRNA文库（图3A），包装成病毒颗粒之后感染HeLa8E细胞，利用嘌呤霉素筛选整合进sgRNA载体的细胞。在开始顺铂耐药性实验前48h，加入Dox以诱导Cas9的表达和对目标基因的编辑。我们设计了3个顺铂浓度梯度，在对照细胞全部死亡之后，撤掉顺铂。从0.9 μg/mL和1.5 μg/mL两组中共长出37个单克隆（图3B），挑选每个单克隆并扩增培养，提取基因组DNA之后PCR扩增包含sgRNA的序列，Sanger测序结果发现21个克隆含有维生素D受体（vitamin D3receptor，VDR）sgRNA，2个克隆含有维甲酸受体β（retinoic acid receptor beta，RARb） sgRNA，含有视黄醇X受体（retinoid x receptor beta，RXRb）和类固醇生成因子⁃1（nuclear receptor 5A1， NR5A1）sgRNA各有1个克隆（图3C），剩下12个克隆sgRNA位点显示乱峰，无法确定具体是哪个sgRNA。为了进一步验证目标基因是否被编辑，我们对21个含有VDR sgRNA单克隆的VDR区域进行了测序，结果显示20个克隆的sgRNA识别区域发生了突变（图3D）。

  • 3 讨论

  • 本研究利用PiggyBac转座子系统，成功构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，并证明在多个位点可以高效切割基因组。同时，我们针对人核受体基因构建了sgRNA文库，在这个细胞系上进行了顺铂耐药性的筛选。之前有研究表明，PiggyBac转座子在转座酶存在的情况下会发生再转座或者丢失的现象[16]，为了防止这种情况的出现，我们转座酶是瞬时表达的，不会持续性存在；同时，在培养HeLa8E细胞株的过程中，也会定期加上Zeocin进行药筛，以排除Cas9丢失和被沉默的可能。除了通过诱导控制Cas9的表达，Cas9切口酶/双sgRNA[7]、截短sgRNA[17]、高保真Cas9突变体[18-23] 等策略也用于降低CRISPR/Cas9的脱靶效应。另外，多个比sp⁃ Cas9小的同系物如saCas9 [24]、Cpf1 [25] 等也被发现，一定程度上解决了转导效率低的问题。关于Cas9在核仁中富集，之前的研究表明，一旦表达sgRNA， Cas9会均匀分布在细胞核中[7]，这种现象是很难用Cas9含有核仁定位信号来解释的[13]，可能是由于Cas9/sgRNA复合体的溶解性更好，亦有可能是其他机制导致，值得进一步的研究。

  • 之前有文章报道核受体基因ERb的激动剂可以调节胶质母细胞瘤细胞对顺铂的敏感性[14]，鼓励我们去探究核受体超家族成员与顺铂耐药性的关系。在筛选的过程中，由于含有RARb、RXRb和NR5A1sgRNA的克隆较少，我们没有进一步去验证对应的基因是否被编辑，以及有12个克隆含有多个sgRNA，也没有进一步去验证具体是哪些基因被编辑，这些都值得继续探索。20个含有VDR sgRNA克隆的测序结果显示，所有单克隆都携带相同的突变，提示这20个单克隆可能来源于同一个细胞，之前有文章报道维生素D3及其受体VDR调控机体的钙磷代谢稳态，对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作用。因此，突变VDR可能会使HeLa8E细胞的增殖加快，导致长出的克隆大部分含有VDR突变，当然，这也可能是顺铂耐药性发生的原因，需要进一步通过直接敲除或者过表达VDR进行正反验证，具体的机制也值得我们深入去解析。

  • 图3 顺铂耐药性核受体基因的筛选

  • Fig.3 Screening of cisplatin⁃resistant nuclear receptor genes

  • 参考文献

    • [1] VASAN N，BASELGA J，HYMAN D M.A view on drug resistance in cancer［J］.Nature，2019，575（7782）：299-309

    • [2] SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al.Ge⁃ nome ⁃ scale CRISPR ⁃Cas9 knockout screening in human cells［J］.Science，2014，343（6166）：84-87

    • [3] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interfer⁃ ence：RNA⁃directed adaptive immunity in bacteria and ar⁃ chaea［J］.Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190

    • [4] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A program⁃ mable dual ⁃RNA ⁃guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］.Science，2012，337（696）：816-821

    • [5] GJ K，DOUDNA J A.CRISPR⁃Cas guides the future of ge⁃ netic engineering［J］.Science，2018，361（645）：866-869

    • [6] KIM S，KIM D，CHO S W，et al.Highly efficient RNA ⁃ guided genome editing in human cells via delivery of puri⁃ fied Cas9 ribonucleoproteins［J］.Genome Res，2014，24（6）：1012-1019

    • [7] SHEN B，ZHANG W，ZHANG J，et al.Efficient genome modification by CRISPR ⁃Cas9 nickase with minimal off ⁃ target effects［J］.Nat Methods，2014，11（4）：399-402

    • [8] WANG W，YANG J，LIU H，et al.Rapid and efficient re⁃ programming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（45）：18283-18288

    • [9] CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engi⁃ neering using CRISPR/Cas systems［J］.Science，2013，339（6121）：819-823

    • [10] SHEN B，ZHANG J，WU H，et al.Generation of gene⁃mod⁃ ified mice via Cas9/RNA ⁃ mediated gene targeting［J］.Cell Res，2013，23（5）：720-723

    • [11] HWANG W Y，FU Y，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR ⁃Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31（3）：227-229

    • [12] MALI P，YANG L H，ESVELT K M，et al.RNA ⁃ guided human genome engineering via Cas9［J］.Science，2013，339（6121）：823-826

    • [13] TAN R，DU W，LIU Y，et al.Nucleolus localization of spy⁃ Cas9 affects its stability and interferes with host protein translation in mammalian cells［J］.Genes Dis，2020，doi：10.1016/j.gendis.2020.09.003

    • [14] ZHAO L，ZHOU S，GUSTAFSSON J.Nuclear receptors：recent drug discovery for cancer therapies［J］.Endocr Rev，2019，40（5）：1207-1249

    • [15] MARINO M，DISTEFANO E，TRENTALANCE A，et al.Estradiol ⁃ induced IP（3）mediates the estrogen receptor activity expressed in human cells［J］.Mol Cell Endocri⁃ nol，2001，182（1）：19-26

    • [16] YUSA K，RAD R，TAKEDA J，et al.Generation of trans⁃ gene⁃free induced pluripotent mouse stem cells by the pig⁃ gyBac transposon［J］.Nat Methods，2009，6（5）：363-369

    • [17] FU Y F，SANDER J D，REYON D，et al.Improving CRIS⁃ PR ⁃Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs ［J］.Nat Biotechnol，2014，32（3）：279-284

    • [18] SCHMID⁃BURGK J L，GAO L，LI D，et al.Highly paral⁃ lel profiling of Cas9 variant specificity［J］.Mol Cell，2020，78（4）：794-800

    • [19] SLAYMAKER I M，GAO L，ZETSCHE B，et al.Rational⁃ ly engineered Cas9 nucleases with improved specificity ［J］.Science，2016，351（6268）：84-88

    • [20] KLEINSTIVER B P，PATTANAYAK V，PREW M S，et al.High⁃fidelity CRISPR⁃Cas9 nucleases with no detect⁃ able genome⁃wide off⁃target effects［J］.Nature，2016，529（7587）：490-495

    • [21] CHEN J S，DAGDAS Y S，KLEINSTIVER B P，et al.En⁃ hanced proofreading governs CRISPR ⁃Cas9 targeting ac⁃ curacy［J］.Nature，2017，550（7676）：407-410

    • [22] HU J H，MILLER S M，GEURTS M H，et al.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity［J］.Nature，2018，556（7699）：57-63

    • [23] LEE J K，JEONG E，LEE J，et al.Directed evolution of CRISPR ⁃ Cas9 to increase its specificity［J］.Nat Com⁃ mun，2018，9（1）：3048

    • [24] RAN F A，CONG L，YAN W X，et al.In vivo genome edit⁃ ing using Staphylococcus aureus Cas9［J］.Nature，2015，520（7546）：186-191

    • [25] ZETSCHE B，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al.Cpf1 is a single RNA⁃guided endonuclease of a class 2 CRISPR⁃Cas system［J］.Cell，2015，163（3）：759-771

  • 基本信息

    中图分类号: R730.5
    文献标识码: A
    DOI: 10.7655/NYDXBNS20211002
    文章编号: 1007-4368(2021)10-1432-09

    基金信息

    南京医科大学自然科学基金(NMUB2019033)；

    引用信息

    稿件历史

    收稿日期: 2020-11-13

  • 参考文献

    • [1] VASAN N，BASELGA J，HYMAN D M.A view on drug resistance in cancer［J］.Nature，2019，575（7782）：299-309

    • [2] SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al.Ge⁃ nome ⁃ scale CRISPR ⁃Cas9 knockout screening in human cells［J］.Science，2014，343（6166）：84-87

    • [3] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interfer⁃ ence：RNA⁃directed adaptive immunity in bacteria and ar⁃ chaea［J］.Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190

    • [4] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I，et al.A program⁃ mable dual ⁃RNA ⁃guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］.Science，2012，337（696）：816-821

    • [5] GJ K，DOUDNA J A.CRISPR⁃Cas guides the future of ge⁃ netic engineering［J］.Science，2018，361（645）：866-869

    • [6] KIM S，KIM D，CHO S W，et al.Highly efficient RNA ⁃ guided genome editing in human cells via delivery of puri⁃ fied Cas9 ribonucleoproteins［J］.Genome Res，2014，24（6）：1012-1019

    • [7] SHEN B，ZHANG W，ZHANG J，et al.Efficient genome modification by CRISPR ⁃Cas9 nickase with minimal off ⁃ target effects［J］.Nat Methods，2014，11（4）：399-402

    • [8] WANG W，YANG J，LIU H，et al.Rapid and efficient re⁃ programming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by retinoic acid receptor gamma and liver receptor homolog 1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（45）：18283-18288

    • [9] CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engi⁃ neering using CRISPR/Cas systems［J］.Science，2013，339（6121）：819-823

    • [10] SHEN B，ZHANG J，WU H，et al.Generation of gene⁃mod⁃ ified mice via Cas9/RNA ⁃ mediated gene targeting［J］.Cell Res，2013，23（5）：720-723

    • [11] HWANG W Y，FU Y，REYON D，et al.Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR ⁃Cas system［J］.Nat Biotechnol，2013，31（3）：227-229

    • [12] MALI P，YANG L H，ESVELT K M，et al.RNA ⁃ guided human genome engineering via Cas9［J］.Science，2013，339（6121）：823-826

    • [13] TAN R，DU W，LIU Y，et al.Nucleolus localization of spy⁃ Cas9 affects its stability and interferes with host protein translation in mammalian cells［J］.Genes Dis，2020，doi：10.1016/j.gendis.2020.09.003

    • [14] ZHAO L，ZHOU S，GUSTAFSSON J.Nuclear receptors：recent drug discovery for cancer therapies［J］.Endocr Rev，2019，40（5）：1207-1249

    • [15] MARINO M，DISTEFANO E，TRENTALANCE A，et al.Estradiol ⁃ induced IP（3）mediates the estrogen receptor activity expressed in human cells［J］.Mol Cell Endocri⁃ nol，2001，182（1）：19-26

    • [16] YUSA K，RAD R，TAKEDA J，et al.Generation of trans⁃ gene⁃free induced pluripotent mouse stem cells by the pig⁃ gyBac transposon［J］.Nat Methods，2009，6（5）：363-369

    • [17] FU Y F，SANDER J D，REYON D，et al.Improving CRIS⁃ PR ⁃Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs ［J］.Nat Biotechnol，2014，32（3）：279-284

    • [18] SCHMID⁃BURGK J L，GAO L，LI D，et al.Highly paral⁃ lel profiling of Cas9 variant specificity［J］.Mol Cell，2020，78（4）：794-800

    • [19] SLAYMAKER I M，GAO L，ZETSCHE B，et al.Rational⁃ ly engineered Cas9 nucleases with improved specificity ［J］.Science，2016，351（6268）：84-88

    • [20] KLEINSTIVER B P，PATTANAYAK V，PREW M S，et al.High⁃fidelity CRISPR⁃Cas9 nucleases with no detect⁃ able genome⁃wide off⁃target effects［J］.Nature，2016，529（7587）：490-495

    • [21] CHEN J S，DAGDAS Y S，KLEINSTIVER B P，et al.En⁃ hanced proofreading governs CRISPR ⁃Cas9 targeting ac⁃ curacy［J］.Nature，2017，550（7676）：407-410

    • [22] HU J H，MILLER S M，GEURTS M H，et al.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity［J］.Nature，2018，556（7699）：57-63

    • [23] LEE J K，JEONG E，LEE J，et al.Directed evolution of CRISPR ⁃ Cas9 to increase its specificity［J］.Nat Com⁃ mun，2018，9（1）：3048

    • [24] RAN F A，CONG L，YAN W X，et al.In vivo genome edit⁃ ing using Staphylococcus aureus Cas9［J］.Nature，2015，520（7546）：186-191

    • [25] ZETSCHE B，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al.Cpf1 is a single RNA⁃guided endonuclease of a class 2 CRISPR⁃Cas system［J］.Cell，2015，163（3）：759-771

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