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氧化锆陶瓷是当前备受关注的牙科种植体候选材料之一，但由于生物惰性，难以实现良好的骨结合[1-2]。在氧化锆表面制备生物活性涂层是目前改善氧化锆表面生物活性的主要方式之一，但远期涂层降解、剥脱等问题无法避免[3-5]。因此，化学改性是一种更可靠的方式。
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硅烷是最常见的一类能够与金属氧化物结合的功能性化合物，其在牙科通常应用在底涂剂、粘接剂以及复合树脂中[6-7]。硅烷能够克服氧化锆表面化学稳定性，与其表面羟基共价缩合形成Zr⁃O⁃Si键[8-9]。
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此外，亲水的氨基、酸酐末端的硅烷已被证实在修饰氧化石墨烯、钛、氧化锆等材料表面具有提高生物相容性和促进成骨的作用[10-12]。本研究的目的是比较接枝不同亲疏水末端基团硅烷的氧化锆表面对小鼠前成骨细胞MC3T3⁃E1生物学行为的影响，为促进氧化锆种植体早期骨结合提供理论依据。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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小鼠前成骨细胞系MC3T3⁃E1（中科院上海细胞库），α⁃MEM培养液、胎牛血清（FBS）、青霉素⁃链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国）、PBS缓冲液（Hyclone公司，美国）、鬼笔环肽、DAPI （Apexbio公司，美国），CCK⁃8试剂盒（Dojindo公司，日本）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所），3⁃（甲基丙烯酰氧） 丙基三甲氧基硅烷（γ⁃MPS）、甲基三甲氧基硅烷 （MTMS）、3⁃巯丙基三甲氧基硅烷（MPTS）、3⁃氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）（上海阿拉丁公司），酶标定量测试仪（Waltham公司，美国）、激光共聚焦显微镜 （LSM 780，CalZeiss AG公司，德国）、X射线能谱（X⁃ ray photoelectron spectroscopy，XPS）仪（Escalab250xi，Thermo Fisher Scientific公司，美国）、X射线衍射（X⁃ray diffraction，XRD）仪（D8ADVANCE，Bruker AXS公司，德国）。
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1.2 方法
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1.2.1 试件的制备及分组
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切割直径分别为5、13mm，厚度为1mm的氧化锆圆片，所有样本在使用前分别经400、600、800、 1 200目的碳化硅纸抛光至镜面。
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实验分6组（n=6），分别为未处理组（NT组）、碱处理组（HT组）、γ⁃MPS处理组（HT⁃MPS组）、MTMS处理组（HT ⁃ MTMS组）、MPTS处理组（HT ⁃ MPTS组）、APTES处理组（HT⁃APTES组）。氧化锆圆片先在浓度5mol/L的氢氧化钠溶液中60℃下过夜浸泡，然后分别用γ⁃MPS（乙烯基末端）、MTMS（甲基末端）、MPTS（巯基末端）、APTES（氨基末端）硅烷溶液处理24h。所有硅烷溶液的浓度为2%，溶剂为无水乙醇。硅烷化的样本分别经无水乙醇、双蒸水超声清洗10min，去除表面未反应的多余硅烷，65℃烘箱干燥。
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1.2.2 XPS分析
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通过XPS分析评估表面化学成分及硅烷化情况。在225W下用单色AlKa辐照（1 486.7eV）进行测量，入射角为90°。使用XPS Peak 4.1软件对01s谱进行分峰处理，用C1（285.0eV）校准每个光谱的结合能。
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1.2.3 扫描电子显微镜观察
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各组氧化锆样本镀金后，使用扫描电子显微镜在背散射电子模式观察表面形貌，加速电压为15kV。
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1.2.4 XRD分析
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通过XRD在掠入射模式下测定氧化锆圆片在硅烷化前后的晶相变化。扫描范围为20°~80°，扫描速度为0.02°/min。
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1.2.5 免疫荧光观察细胞黏附及形态
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将各组消毒灭菌后直径为5mm的氧化锆圆片置于96孔板，MC3T3⁃E1细胞接种密度为3 000个/孔，每个组分别设置3个平行对照组。细胞培养24h后，用PBS漂洗2遍后，使用4%的多聚甲醛溶液固定10min，PBS漂洗细胞2遍，每孔加入l mL 0.1%Triton⁃X 100通透液，然后用稀释过的罗丹明⁃鬼笔环肽染色40min后用PBS漂洗。每孔加入100 μL稀释过的DAPI染色剂（稀释比例按说明书进行），进行细胞核的染色，染色时间为2min。将荧光淬灭剂滴到盖玻片上，在激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照。
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1.2.6 CCK⁃8法检测细胞增殖
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使用CCK⁃8法测定1、3、5d的细胞数。将各组消毒灭菌后的直径为5mm的氧化锆圆片置于96孔板，MC3T3⁃E1细胞接种密度为3 000个/孔，每个组分别设置3个平行对照组。培养到设定时间点后，吸去培养基，PBS冲洗两遍，向每孔加入100 μL培养基和10 μL CCK⁃8液培养2h。使用酶标定量测试仪测定在450nm处的吸光度。
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1.2.7 ALP活性测定
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ALP是检测细胞早期成骨分化的重要指标之一。将各组消毒灭菌后的直径为13mm的氧化锆圆片置于24孔板，MC3T3⁃E1细胞的接种密度为1 ×104 个/孔，每个组分别设置3个平行对照组。培养到设定时间点后，吸去培养基，PBS冲洗两遍，加入0.1％ Triton X⁃100 500 μL，经振荡后按照ALP测定试剂盒说明进行操作，酶标仪560nm处测定吸光度值。BCA试剂盒测量蛋白总浓度并进行标准化。
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1.3 统计学方法
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采用SPSS 22.0软件对材料表面细胞增殖实验以及ALP活性实验数据进行统计分析，各组数据满足正态分布和方差齐性，对各组数据进行单因素方差分析，并用LSD法进行多重比较，P ＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 XPS结果
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表1为各组氧化锆试件表面的原子百分比。经碱热处理后试件表面的C含量减少，O含量增加。经过硅烷改性的HT⁃MPS、HT⁃MTMS、HT⁃MPTS、HT⁃ APTES相较NT组和HT组Si含量明显提高，分别为9.57%、11.48%、9.18%和8.23%。此外，巯基硅烷改性的表面检测到4.17%S元素，氨基硅烷改性的氧化锆表面检测到3.27%N元素。
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XPS总谱（图1）结果显示，HT⁃MPS、HT⁃MTMS、 HT⁃MPTS、HT⁃APTES组在346eV附近的Zr3p1峰， 332eV附近的Zr3p2峰，180eV附近的Zr3d峰分别出现下降，在102eV附近出现Si峰。
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2.2 SEM结果
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图2为各组氧化锆表面形态观察结果，可见碱热及硅烷处理并未造成氧化锆表面腐蚀空隙，表面形貌未发生明显改变。
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图1 氧化锆试表面硅烷化前后的X射线光电子能谱结果
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Fig.1 X ⁃Ray photoelectron spectrum of zirconia surface before and after silanization
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2.3 XRD结果
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图3 的XRD结果显示，在29.6°、34.6°、49.8°、 59.3°附近观察到氧化锆四方相的特征峰[13]，且各组氧化锆表面晶相未发生明显改变。
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2.4 细胞黏附及形态观察
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MC3T3⁃E1细胞在氧化锆表面培养24h后进行染色，通过激光共聚焦显微镜对细胞黏附及形态进行观察（图4）。24h免疫荧光染色显示，HT⁃MPS组、HT⁃MTMS组氧化锆表面细胞密度明显低于NT组、HT组、HT⁃MPTS组、HT⁃APTES组。HT组、HT⁃ MPTS组、HT⁃APTES组表面的细胞呈良好的扩散和多边形形态，细胞间可见微丝形成的细胞骨架交通互相联络，而NT组细胞呈平铺状态黏附于氧化锆表面，HT⁃MPS组、HT⁃MTMS组细胞则存在折叠、未铺展的情况。
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图2 氧化锆改性前后表面形貌观察结果（×10 000）
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Fig.2 Scanning electron microscope observation of zirconia surface before and after modification（×10 000）
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图3 氧化锆表面硅烷化前后的X射线衍射结果
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Fig.3 X⁃ray diffraction patterns of zirconia surface be⁃ fore and after silanization
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2.5 细胞增殖活性检测
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图5为MC3T3⁃E1细胞在各组不同的氧化锆样本表面培养1、3、5d后的细胞增殖情况。当培养到第5天时，HT⁃MPTS、HT⁃APTES组的细胞增殖情况好于NT组，而HT⁃MPS、HT⁃MTMS组与NT组差异无统计学意义（P> 0.05）。
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图4 MC3T3⁃E1细胞在各组氧化锆表面培养24h后的免疫荧光图像
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Fig.4 Immunofluorescence staining of MC3T3⁃E1cells at 24h after seeding on zirconia suface
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2.6 ALP活性检测
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图6显示了各组氧化锆样本表面MC3T3⁃E1细胞在成骨诱导培养7、14d后ALP的相对表达情况。在第7天时，HT⁃APTES组的ALP表达提高，与NT组相比差异有统计学意义（P< 0.05）。当培养14d后，HT⁃MTMS组、HT⁃MPTS组和HT⁃APTES组ALP表达与NT组差异有统计学意义（P< 0.05），其中HT⁃MPTS组、HT⁃APTES组ALP呈高表达，而HT⁃ MTMS组ALP的表达出现明显下降。
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3 讨论
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早期骨结合是影响种植成功的关键因素，而促进种植体周围良好的细胞生物学行为和骨结合在于材料表面形貌及其化学组成[14-15]。传统的氧化锆表面处理通过喷砂、酸蚀等方式改变表面形貌增加粗糙度，但其会破坏氧化锆表面完整性，产生微裂纹，进而影响机械性能[16]。通过共价结合方式长效稳定地改变氧化锆表面化学结构，无疑是一条理想途径。课题组以往研究已经证实硅烷通过其一端的烷氧基水解为硅醇后，与氧化锆表面的羟基共价缩合形成Zr⁃O⁃Si键，且硅烷另一端的有机官能团将影响硅烷水解为硅醇的效率，进而影响硅烷与氧化锆之间的化学亲和性[8]。
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图5 MC3T3⁃E1细胞增殖情况
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Fig.5 Proliferation of MC3T3⁃E1cells
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图6 MC3T3⁃E1细胞ALP表达情况
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Fig.6 ALP protein expression of MC3T3⁃E1cells
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由于氧化锆呈化学惰性，表面羟基含量较少，以往研究证实通过紫外线、氧等离子体喷涂、碱化处理等方式均能够提高氧化锆表面的羟基密度[17-18]。因此本研究预先采取碱化处理以提高氧化锆表面的羟基密度，进而接枝硅烷提高硅烷与氧化锆间的结合效率。X射线光电子能谱结果显示氧化锆表面经碱热处理后，其表面的C元素下降，O元素含量提高，一定程度上说明碱热处理有效提高了氧化锆表面的羟基含量。从图1可见各硅烷改性组在346eV附近的Zr3p1峰、332eV附近的Zr3p2峰、180eV附近的Zr3d峰分别出现下降，而在102eV附近出现Si峰，且HT⁃MPS组、HT⁃MTMS组、HT⁃MPTS组、HT⁃ APTES组氧化锆表面Si元素原子百分比分别提高至9.57%、11.48%、9.18%、8.23%，说明硅烷有效接枝到氧化锆表面。在NT组及HT组氧化锆样本表面同样检测出了少量的Si元素，这或许是因为在用碳化硅纸进行抛光处理时，C、Si元素残留在样本表面。
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此外，X射线衍射结果证实碱热及硅烷处理均不会破坏氧化锆表面结构的完整性以及晶相的构成，说明该处理方式不存在远期影响氧化锆种植体机械性能的风险。此外，以往文献报道具有四方相占比高的光滑氧化锆表面能够促进MG⁃63的细胞生物学行为[19]。
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材料表面的亲疏水性很大程度上影响细胞的黏附性为，通常认为亲水性表面有利于细胞黏附[20]。免疫荧光图像显示，在HT、HT⁃MPTS、HT⁃APTES表面的细胞呈良好的扩散和多边形形态，细胞间可见微丝形成的细胞骨架交通互相联络，而NT组细胞呈平铺状态黏附于氧化锆表面，HT⁃MPS组、HT⁃MTMS组细胞则存在折叠、未铺展的情况，并且HT⁃MPS、 HT⁃MTMS氧化锆表面细胞密度明显低于NT组、HT组、HT⁃MPTS组、HT⁃APTES组，说明不同末端基团硅烷改性的氧化锆表面影响细胞的早期黏附，其中亲水氨基、巯基末端改性的氧化锆表面对MC3T3⁃ E1细胞的黏附有一定促进作用。这可能是由于亲水末端硅烷接枝的氧化锆表面亲水性增加，而甲基、乙烯基末端硅烷接枝的氧化锆表面更加疏水。而HT对表面细胞同样呈现有利的黏附作用，因为碱化处理可使材料表面亲水性增加。细胞增殖实验提示当细胞培养到第3天和第5天时，HT⁃MPTS组、HT⁃APTES组的吸光度值明显提高，说明亲水氨基、巯基末端硅烷能够促进MC3T3⁃E1细胞增殖。结合以往研究酸酐末端改性的钛表面能够促进Sao⁃2细胞增殖[12]，氨基末端硅烷改性的氧化石墨烯表面能够促进人成纤维细胞HADF、小鼠胚胎成纤维细胞NIH⁃3T3、MG⁃63等多种细胞的增殖[10]，或许可以认为促进细胞增殖是亲水末端硅烷的共性，而非局限于特定的末端硅烷。MC3T3⁃E1细胞的早期分化可以通过检测ALP的表达来评价。根据对各组细胞培养7、14d后的ALP定量检测情况，HT⁃MPTS和HT⁃APTES组吸光度值提高，而HT⁃MPS组和HT⁃ MTMS组吸光度值下降，说明亲水氨基、巯基末端硅烷能够促进MC3T3⁃E1细胞分化，疏水甲基、乙烯基末端硅烷抑制其分化，亲水末端硅烷促进MC3T3⁃E1细胞分化的具体机制有待进一步研究。
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本研究观察比较了4种不同亲疏水末端硅烷改性的氧化锆表面对MC3T3⁃E1细胞黏附、增殖和分化的影响。以上实验结果认为亲水末端硅烷应用于氧化锆种植体表面能够促进早期骨结合。此外，硅烷作为偶联剂不仅单独提供活性，其末端的有机官能团能够与有机物结合，提供一个结合其他活性成分的平台，潜在地拓宽了氧化锆表面改性的策略，为推进氧化锆种植体的临床应用提供了基础。
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摘要
目的：观察接枝不同末端硅烷的氧化锆材料对MC3T3⁃E1小鼠前成骨细胞黏附、增殖和分化的影响。方法：通过共价结合的方式在氧化锆表面接枝不同末端基团的硅烷，X射线光电子能谱（X⁃ray photoelectron spectroscopy，XPS）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、X射线衍射（X⁃ray diffraction，XRD）分析检测各组氧化锆表面的理化表征，通过激光共聚焦显微镜观察MC3T3⁃E1细胞在24 h时的黏附及形态，在培养1、3、5 d后通过CCK⁃8法评价各组细胞增殖水平，使用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨细胞培养7、14 d后的分化情况。结果：XPS结果显示4种不同末端硅烷均成功接枝到氧化锆表面； SEM、XRD结果提示碱热及硅烷处理不破坏氧化锆表面完整性及晶相结构；MC3T3⁃E1细胞在接枝亲水的氨基、巯基末端硅烷的氧化锆表面黏附情况好，增殖活性高，且碱性磷酸酶的表达较未处理组高，而疏水末端甲基、乙烯基末端硅烷对细胞增殖无明显影响，对细胞分化起抑制作用。结论：接枝亲水末端硅烷的氧化锆表面对小鼠成骨细胞的黏附、增殖和分化均有促进作用。
Abstract
Objective：This study aims to investigate the influence of silanes with different end groups grafting on the zirconia surface on the adhesion，proliferation and differentiation of osteoblast． Methods：A self ⁃ assembled monolayer was formed on the surface of zirconia by covalent bonding. After hydroxylation，zirconia surface was grafted with different terminal groups of silanes，and then mouse preosteoblasts are cultured on the surface. X⁃ray photoelectron spectroscopy（XPS），scanning electron microscope（SEM） and X ⁃ ray diffraction（XRD）analysis were used to detect the physical and chemical characteristics of the zirconia surface. The adhesion and morphology of MC3T3⁃E1 cells were observed by laser confocal microscope after 24 h culture. After 1，3 and 5 days，the cell proliferation level of each group was evaluated by the CCK ⁃ 8 assay，and the differentiation of osteoblasts after 7 and 14 days of culture was detected by the alkaline phosphatase kit. Results：XPS results showed that the four different terminal silanes were successfully grafted to the zirconia surface. SEM and XRD results indicated that alkali heat and silane treatment had no obvious impact on the topography and crystal phase of zirconia surface. Zirconia grafted with hydrophilic terminal amino ⁃ and mercapto ⁃ silanes， presented excellent adhesion and high proliferation activity，and the expression of alkaline phosphatase is higher than that of the untreated group，while the hydrophobic methyl ⁃ and vinyl ⁃ silanes has no obvious effect on cell proliferation，and inhibit cell differentiation. Conclusion：Zirconia modified with hydrophilic end groups（such as mercapto and amino）of silanes can promote cell adhesion，proliferation and differentiation.
Keywords
silane ； zirconia implant ； surface modification ； osteogenesis