肺癌（亦称支气管肺癌）是一种发生于支气管黏膜上皮组织的恶性肿瘤，通常分为小细胞肺癌 （small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non⁃ small cell lung cancer，NSCLC）两大类^[1]。由于绝大多数肺癌患者属于NSCLC（约为85%），加上近年来NSCLC的发病率和病死率呈逐年升高的趋势^[2]，故深入探讨NSCLC的病因和发病机制具有十分重要的意义。

NSCLC的形成不仅与遗传和环境等因素有关^[3]，而且还与肿瘤局部微环境中的某些促炎因子（如TNF⁃α和IL⁃6）和补体（如C3a和C5a）的作用明显相关^[4-5]。研究发现，补体C5a不仅可由补体系统3条途径激活时产生，还可由肿瘤组织本身产生^[6]。肿瘤局部微环境中的补体C5a通过其C5a受体（C5aR） 作用于靶细胞，既能调节免疫应答，又能促进肿瘤的生长和转移^[7]。NSCLC患者血浆和癌组织中C5a含量明显增多，并能促进NSCLC细胞的增殖^[5]。本课题前期研究发现，体外用C5a刺激NSCLC细胞不仅能促进细胞的增殖还能增强细胞的迁移，但有关C5a促NSCLC细胞增殖和迁移的分子机制，目前尚不清楚。

据报道，C5a诱导靶细胞的生物学效应通常与靶细胞内某些信号通路的活化有关，例如C5a可激活丝/苏氨酸蛋白激酶Akt1、细胞外信号调节激酶1/2 （extracellular signal⁃regulated kinase，ERK1/2）等^[8-9]。已知，Akt1活化与多种肿瘤细胞的增殖和活化密切相关。Akt1可通过激活其下游分子如mTOR等促进肿瘤细胞的增殖、迁移以及肿瘤血管的形成^[10]。此外，ERK1/2是MAPK家族中重要成员。作为高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，ERK1/2可识别并磷酸化特定的底物蛋白，在细胞的增殖与分化等活动中发挥重要作用^[10]。文献报道C5a可通过活化Akt1促进乳腺癌细胞的增殖^[7]。此外，C5a还可通过激活ERK1/2增强肾癌细胞的增殖和侵袭能力^[12]。但是，有关C5a作用于NSCLC细胞后信号通路的激活情况尚未见文献报道。

本课题的前期研究已发现，用C5a刺激体外培养的NSCLC细胞后，NSCLC细胞的增殖和迁移能力均显著提高，且Akt1和ERK1/2的磷酸化水平也同步上调，故推测C5a刺激NSCLC细胞后，可能通过激活Akt1或ERK1/2信号分子促进细胞的增殖和迁移。鉴于此，本课题开展了以下实验，研究C5a激活Akt1和ERK1/2促进NSCLC细胞的增殖和迁移的作用与机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常支气管上皮细胞系BEAS ⁃ 2B和3种NSCLC细胞系（H1703、PC9、H1299）均由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。人C5a蛋白（R&D Systems公司，美国），抗C5aR抗体（武汉Abclonal公司），抗总Akt1（t ⁃ Akt1）、磷酸化Akt1（p ⁃ Akt1， Ser473）、总ERK1/2（t⁃ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p⁃ ERK1/2，Thr202/Tyr204）、总PKC⁃α（t⁃PKC⁃α）、磷酸化p⁃PKC⁃α（p⁃PKC⁃α，Thr638）的抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）。HRP标记山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（合肥Biosharp公司）。Perifosine （Akt1抑制剂）和U0126（ERK1/2抑制剂）（上海MCE公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Wisent公司，加拿大）。DMEM（Gbico公司，美国）。CCK⁃8试剂盒（上海MCE公司）。

1.2 方法

1.2.1 BEAS⁃2B、H1703、PC9和H1299细胞系的培养

将前述细胞系接种于含10%FBS的DMEM完全培养液中，置于37℃、5%CO₂孵箱中培养48h。当细胞融合度达到90%时，按1∶3比例进行细胞传代，并继续培养。

1.2.2 BEAS⁃2B、H1703、PC9和H1299细胞系C5aR表达的检查

RT⁃PCR：根据NCBI数据库找到目的基因CDS区，利用Premier 5软件进行引物设计，并交由通用生物系统有限公司合成。序列如下：C5aR（上游5′⁃ ACTACAGCCACGACAAACG⁃3′；下游5′⁃CCCTAAC⁃ CACGGACTCTTC ⁃3′），GAPDH（上游5′ ⁃CAAGGT⁃ CATCCATGACAACTTTG ⁃ 3′；下游5′ ⁃ GTCCAC⁃ CACCCTGTTGCTGTAG ⁃ 3′）。提取前述细胞总RNA，逆转录为cDNA，以此cDNA为模板，用Prime STAR@Max DNA Polymerase进行PCR反应，最终扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并拍照成像。

Western blot：将上述细胞裂解物离心3min，取30 μg蛋白行SDS⁃PAGE电泳，先用45V恒压浓缩，再用120V电泳2h，接着用0.3A湿转120min，待蛋白转印到PVDF膜上后再用脱脂奶粉溶液封闭2h，加入抗C5aR抗体4℃孵育过夜。漂洗后用HRP标记的二抗室温孵育1h，最后行ECL化学发光试剂检测。

1.2.3 Western blot实验检测PC9 细胞中Akt1、 ERK1/2、PKC⁃α磷酸化水平

收集C5a刺激PC9细胞后不同时间点的细胞蛋白，行Western blot检测Akt1、ERK1/2、PKC⁃α的表达和磷酸化水平，方法同前。用10 μmol/L Perifosine或U0126分别处理PC9细胞30min，然后加入50ng/mL C5a共同孵育3h，行Western blot检测Akt1和ERK1/2的表达和磷酸化。

1.2.4 CCK⁃8实验检测PC9细胞的增殖

将PC9细胞种植于96孔板，24h后换成无血清DMEM培养24h，接着用不同浓度的C5a刺激细胞48h，每孔加入10 μL的CCK⁃8溶液，在37℃孵育40~50min，用酶标仪测定450nm处的吸光度。同上将细胞接种至96孔板，分别用10 μmol/L Perifosine和U0126处理细胞30min，再用50ng/mL C5a刺激细胞48h，开展CCK⁃8实验检测细胞增殖水平。

1.2.5 细胞划痕实验检测PC9细胞的迁移

将PC9细胞接种于6孔板，24h后换成无血清DMEM培养12h。通过200 μL移液器吸头产生细胞单层的线性伤口，用PBS清洗脱落的细胞，加入含1%FBS的DMEM，同时加入不同浓度的C5a继续培养，并于24h和48h时观察细胞的迁移情况。同上将细胞接种至6孔板，进行细胞划痕，用10 μmol/L浓度的Perifosine和U0126分别处理细胞，30min后再用50ng/mL的C5a处理细胞24h和48h，观察其迁移情况。

1.3 统计学方法

所有实验均独立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}\pm s_{\stackrel{-}{x}}$）表示。采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，多组间比较则采用单因素方差分析，Bonfferoni法进行两两比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC细胞系中C5aR的表达情况

首先检测了正常支气管上皮细胞（BEAS⁃2B）以及3种常见的NSCLC细胞系（H1703、PC9和H1299） 中C5aR的表达情况。结果显示，C5aR在PC9和H1703细胞中均有明显的表达，但以PC9细胞的表达水平最高（图1），故后续实验选择了PC9细胞系进行相关实验。

2.2 C5a刺激PC9细胞后诱导细胞增殖和迁移及其刺激剂量的确定

2.2.1 不同浓度C5a刺激PC9细胞后细胞增殖能力的变化

在证实了PC9细胞高表达C5aR后，分别用0、 0.05、0.50、5.00，50.00、500.00ng/mL的C5a刺激PC9细胞，48h后行CCK⁃8实验检测细胞的增殖情况。结果发现，PC9细胞的增殖随着C5a刺激剂量的加大逐渐增强，当刺激剂量为50.00和500.00ng/mL时，细胞增殖最为显著（图2）。

2.2.2 不同浓度C5a刺激PC9细胞后细胞迁移能力的改变

分别用0、0.05、0.50、5.00、50.00、500.00ng/mL C5a刺激PC9细胞48h后，行划痕实验检测细胞的迁移情况。结果显示，C5a以剂量依赖性的方式促进细胞的迁移，其中以50.00和500.00ng/mL剂量的效果最为显著（图3）。由于50.00ng/mL和500.00ng/mL C5a刺激剂量之间细胞增殖和迁移水平无显著差异，故选择用50.00ng/mL剂量开展后续的实验。

2.2.3 C5a促进PC9细胞Akt1和ERK1/2的磷酸化

为了探讨C5a诱导PC9增殖和迁移的潜在机制，用C5a刺激PC9细胞，在不同时间点（0h、1h、2h、3h、6h、12h）检测增殖和迁移相关的信号分子Akt1、ERK1/2和PKC⁃α的表达与磷酸化情况。结果显示，C5a刺激PC9细胞后，显著增强Akt1和ERK1/2的磷酸化水平，且其峰值在3h左右，而PKC⁃α的表达和磷酸化均未见明显变化（图4）。

2.2.4 C5a通过Akt1⁃ERK1/2 通路诱导PC9 细胞增殖和迁移

进一步探讨了Akt1和ERK1/2在C5a诱导PC9细胞增殖和迁移的作用。用Akt1抑制剂Perifosine和ERK1/2抑制剂U0126分别处理PC9细胞30min （设DMSO溶剂对照），接着用C5a刺激3h后，行Western blot检测Akt1和ERK1/2的表达和磷酸化。结果显示，Perifosine和U0126可分别阻断Akt1和ERK1/2的磷酸化，且均不影响其蛋白表达。此外， Perifosine能下调ERK1/2的磷酸化，而U0126对Akt1的磷酸化没有明显影响（图5），提示C5a刺激PC9细胞后Akt1和ERK1/2的活化可能存在一定的上下游关系，即C5a刺激PC9细胞后通过激活Akt1诱导ERK1/2的活化。CCK⁃8和细胞划痕实验进一步表明，抑制Akt1和ERK1/2可以显著减弱C5a上调的PC9细胞增殖和迁移（图6）。上述结果表明， C5a刺激PC9细胞后可通过激活Akt1⁃ERK1/2通路促进PC9细胞的增殖和迁移。

3 讨论

NSCLC是最常见的肺部原发性恶性肿瘤。在我国，NSCLC已成为发病率和死亡率均排在首位的恶性肿瘤^[1]，但截至目前，有关NSCLC的病因和发病机制尚未完全明了，其可能与NSCLC肿瘤微环境中的某些促炎因子或补体成分（如C5a）的上调有一定关系^[3，12]。

已知C5a是补体系统通过3条途径激活时形成的C5裂解片段。对于肿瘤生长而言，C5a既能作为趋化因子招募中性粒细胞和单核巨噬细胞等入侵肿瘤局部，释放更多的促炎因子，又能作为刺激物直接诱导肿瘤细胞的增殖^[4]。NSCLC患者体内可检测到C5a水平显著升高，且患者体内升高的C5a不仅与其补体系统的活化相关，而且还可来源于NSCLC细胞本身^[14]。本研究发现，体外用C5a刺激NSCLC细胞不仅能促进细胞的增殖，还能增强细胞的迁移，因此又进一步研究C5a刺激NSCLC细胞增殖和迁移可能涉及的分子机制。

众所周知，肿瘤细胞的增殖和迁移与其胞内的信号通路的活化密切相关，但有关C5a刺激NSCLC细胞后能否开启某些信号通路，目前尚不清楚。据此，本实验用Western blot检测了一些信号分子的磷酸化（即活化）情况。结果发现，C5a刺激PC9细胞后其Akt1和ERK1/2的磷酸化显著增加。Akt1和ERK1/2抑制剂可明显下调由C5a刺激PC9细胞后诱导的细胞增殖和迁移，提示Akt1和ERK1/2均参与调控C5a诱导PC9细胞的增殖和迁移作用。值得一提的是，文献报道C5a也可作用于其他肿瘤细胞，并激活Akt1或ERK1/2。例如，Lu等^[7] 报道C5a可通过活化Akt1调控补体应答基因⁃32（complement response gene⁃32，RGC⁃32）基因的表达，促进乳腺癌细胞的增殖；Maeda等^[12] 研究发现，C5a在转移性肾细胞癌中高表达，并可通过激活ERK1/2促进癌细胞的侵袭。由此可见，多种肿瘤组织的肿瘤微环境中C5a含量均显著上调，上调的C5a可通过活化Akt1或ERK1/2促进肿瘤细胞的增殖和迁移。

已有文献报道，生物碱Cyclovirobuxine D（CVB D）可以通过Akt1⁃ERK1/2信号通路抑制结直肠癌肿瘤发生^[15]，但C5a活化Akt1或ERK1/2是否存在相互作用，目前尚不知晓。因此又开展相应的实验，研究Akt1和ERK1/2之间是否存在上下游调控的关系。结果显示，在受C5a刺激的PC9细胞中， Perifosine能同时下调Akt1和ERK1/2的磷酸化，而U0126仅能抑制ERK1/2磷酸化，却对Akt1磷酸化水平没有明显的影响，提示C5a刺激PC9细胞后或许能通过激活Akt1诱导ERK1/2的活化。

综上所述，本研究提示，C5a刺激NSCLC细胞后可能通过活化Akt1⁃ERK1/2通路促进NSCLC细胞的增殖和迁移，这为探究NSCLC的发病机制提供了新的思路和实验根据。

参考文献