骨质疏松是全世界范围内的健康难题，其发病与成骨、破骨代谢之间的失衡有关。促进骨形成、探究其相关分子生物学机制，对防治骨质疏松具有重大意义。骨髓间充质干细胞（bone marrow ⁃ de⁃ rived mesenchymal stem cell，BMSC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群，在体内不同环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞，其分化去向在全身的骨代谢中起到了重要作用^[1]，外部因素及其信号处理过程如何调控BMSC分化去向是当前研究的热点。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是高度结构化的RNA转录本，长度超过200个核苷酸，不直接参与蛋白的翻译过程^[2]。起初认为lncRNA不具备生物学功能，近来研究发现lncRNA可广泛参与基因的表达调控，调节细胞的增殖、分化、凋亡，并与个体的生长发育相关^[2]。研究表明，lncRNA在基因水平对BMSC的调控起重要作用，参与BMSC分化调控过程中复杂的信号通路，从而间接调控骨质疏松疾病的发生和发展[3⁃6]，但具体调节机制仍不明确。本研究拟通过制备卵巢切除骨质疏松模型，并培养骨质疏松模型大鼠的BMSC，对细胞内lncRNA进行检测，对比研究相关差异lncRNA基因的生物学功能及参与的相关信号通路，为后期进一步的验证及功能研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

选取雌性SD大鼠12只，体重（250±10）g，由南京医科大学实验动物中心提供。所有实验均通过南京市中医院伦理委员会批准同意。12只SD大鼠分为对照组和骨质疏松组，每组6只。骨质疏松组采用切除卵巢的方法制作模型，对照组仅采用腹部切开不作卵巢切除，均饲养3个月。3个月后每组取3只SD大鼠的BMSC用于基因芯片检测。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠卵巢切除骨质疏松模型建立

根据文献方法制作SD大鼠骨质疏松模型^[7]，采用10%水合氯醛以1mL/250g的剂量腹腔内注射麻醉，待麻醉满意后大鼠腹部剪毛，采用碘伏进行局部皮肤消毒，沿着腹部中线中下部正中作2cm长切口，将皮肤牵开，切开腹膜，进入腹腔，沿双侧子宫外上角的输卵管找到卵巢，丝线结扎卵巢蒂部，切除大鼠卵巢并取出，缝合腹膜和皮肤切口。对照组SD大鼠仅切开腹部后沿着输卵管显露卵巢，但不作卵巢切除，缝合腹膜及皮肤。

1.2.2 骨密度（bone mineral density，BMD）检测

根据实验设计，在实验开始时和饲养3个月后分别检测SD大鼠的骨密度并进行比较。采用10%水合氯醛以1mL/250g剂量腹腔内注射麻醉，待麻醉满意后，将其四肢展开俯卧于双能X线吸收测量仪（GE公司，美国）平台上，通过小动物软件测定系统测定各组小鼠全身骨骼的骨密度。

1.2.3 BMSC的分离提取、培养及鉴定

饲养3个月后的SD大鼠，根据文献介绍方法^[8]，取大鼠右侧股骨干，无菌条件下沿两侧干骺端剪断，暴露骨髓腔，并以1mL无菌注射器吸取培养基反复冲洗，直至流出的液体变为清亮并且骨的颜色发白；用移液器将含有小鼠骨髓液的培养基转移至15mL离心管，轻柔吹打，去除残渣，经离心、重悬后以1×10⁶ 个/瓶的浓度接种于培养皿内，置于培养箱中，每隔2d更换1次培养液，待细胞融合约80%~90%时进行传代操作。选取第3代BMSC，常规消化并制备细胞悬液，1 000r/min室温离心5min后PBS缓冲液重悬细胞，并调整浓度5×10⁶ 个/mL加入流式细胞管，在避光条件下按说明书每管分别加入荧光标记的CD45、CD90抗体，4℃避光孵育1h，对细胞进行1 000r/min室温离心5min后PBS洗涤3次，将细胞重悬于加入约1mL PBS缓冲液，运用流式细胞仪检测并计算阳性细胞的比例，结果显示CD45⁺ 细胞比例<1%，而CD90⁺ 细胞比例> 95%。

1.2.4 基因芯片检测差异lncRNA

根据实验设计，取饲养3个月后的骨质疏松模型组大鼠3只和对照组大鼠3只，培养其BMSC，利用基因芯片技术检测BMSC内差异lncRNA。

在Illumina TruSeq^™ RNA样品准备试剂盒使用说明书指导下进行RNA提取及文库的制备，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。利用Trimmo⁃matic（v0.32）进行基因数据质量过滤，保留基因质量在20以上的碱基。基因差异表达的计量数据为基因表达水平分析中得到的readcount数据。采用deseq进行分析，采用Quantile的Normalization方法，选取P< 0.05、差异倍数>2即|log₂FC|> 1的基因作为差异表达的基因列出。

1.2.5 GO功能和KEGG信号通路富集度分析

通过GO分类号和GO数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，对基因的功能进行描述，通过分析明确差异基因主要参与的生物功能。对差异表达lncRNA的共表达靶基因mRNA做KEGG信号通路富集分析，判定差异基因主要影响的生物学功能或者信号通路。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件包进行数据分析，所有数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示。采用Shapiro⁃ Wilk法检验数据是否服从正态分布，对符合正态分布的计量资料，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨密度变化

所有12只大鼠均顺利完成手术并饲养3个月。骨质疏松模型组和对照组SD大鼠术前骨密度差异无统计学意义[（182.33±4.50）mg/cm² vs.（184.17± 4.49）mg/cm²，P> 0.05]；骨质疏松模型组SD大鼠3个月后骨密度为较对照组大鼠显著降低[（157.33± 6.28）mg/cm² vs.（183.33±4.50）mg/cm²，P< 0.05]，同时较切除卵巢前显著降低（P< 0.05，图1）。

2.2 大鼠BMSC内lncRNA的差异表达

骨质疏松模型组和对照组SD大鼠BMSC内检测出基因片段共计32 759个，差异有统计学意义（P< 0.05）的有8 454个，其中上调3 593个，下调4 861个。检测到的lncRNA基因片段共4 992个，按照|log₂FC|> 1、P< 0.05的评价标准，骨质疏松模型组和对照组大鼠BMSC内共116个lncRNA差异有统计学意义（P< 0.05），占所有lncRNA基因的2.3%，其中上调35个，下调81个。聚类热图和火山图分析结果提示差异谱结果可靠（图2）。

2.3 差异lncRNA高级分析结果

通过高级分析最终筛选出18个lncRNA差异具有统计学意义（P< 0.05），其|log₂FC|值均在6以上，其中上调的基因数为3个，占总数的16.7%，下调的基因个数为15个，占总数的83.3%。通过“cis”调控机制来预测差异lncRNA的靶基因4 532个，上述 |log₂FC|值均在6以上的18个lncRNA的预测下游mRNA基因见表1。

对基因芯片技术检测到的差异基因、同时又被预测为差异lncRNA可能调控靶标的编码基因，取交集共计273个基因进行GO分析、KEGG信号通路富集度分析（图3）。根据GO功能分析，生物学过程（BP）中基因分布前5位的分别是发育过程 （GO：0032502）、细胞生长（GO：0001558），解剖结构的发育（GO：0048856）、刺激反应（GO：0048583）和细胞蛋白代谢过程（GO：0032268）。细胞成分（CC） 方面，显著差异lncRNA主要存在于异染色质、与膜相连的细胞器、核内腔、激活素A复合体内。

差异lncRNA主要富集的KEGG信号通路，前5个信号通路分别是：蛋白的转运通路、味觉的传导通路、核黄素的新陈代谢通路、泛酸盐和辅酶A的生物合成通路与扩张型心肌病相关通路，这些通路可能间接调控骨质疏松的病理生理过程。

3 讨论

随着社会老年化人口的增加，骨质疏松的发病率越来越高，其发病可以归因于不平衡的成骨和破骨过程，但是其更详细的发病机制尚不清楚。卵巢切除是制作骨质疏松模型的方法之一^[7]。通过对卵巢切除骨质疏松模型与正常大鼠的骨密度结果对比发现，卵巢切除3个月后，SD大鼠的骨密度显著降低，进一步说明骨质疏松模型制作成功。

BMSC是成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞等的前体干细胞，其向不同方向分化对成骨形成和破骨吸收平衡作用至关重要^[1]。抑制BMSC成脂、破骨分化，促进其成骨分化，纠正骨代谢失衡是治疗骨质疏松的研究方向之一^[9-10]。在骨质疏松的发病过程中， lncRNA参与了细胞增殖、凋亡和炎症反应的调控， lncRNA在骨质疏松中的具体作用机制尚不明确^[11]。

lncRNA对BMSC的成骨分化发挥重要作用。通过对人BMSC的研究发现，下调lncRNA ENST00000502125.2可导致BMSC内的碱性磷酸酶染色强度明显增强，染色结节的数也显著增多，表明细胞向成骨性细胞分化^[5]。lncRNA H19在BMSC成骨分化过程中表达显著，miR⁃140⁃5p表达显著降低，功能分析显示lncRNA H19过度表达可抑制miR ⁃140⁃5p表达，加速成骨BMSC分化，而lncRNA H19缺失则抑制了BMSC的成骨分化过程，lncRNA H19可调控BMSC分化过程^[3]。同样，lncRNA MEG3的下调能显著抑制BMSC的成骨能力，其过表达则能提高BMSC的成骨能力，其对成骨分化的调节作用可能是通过激活骨形态发生蛋白4（BMP⁃4）来实现的^[6]。

本研究中，在骨质疏松模型大鼠BMSC内有116个lncRNA的表达差异具有统计学意义，占所有lncRNA基因的2.3%，其中上调的lncRNA 35个，下调81个。根据GO功能分析，这些差异lncRNA主要参与细胞生长发育、解剖结构发育的调控、对应激反应的调节、对细胞蛋白代谢过程的调控。差异lncRNA主要富集的KEGG信号通路包括蛋白的转运通路、味觉的传导通路、核黄素的新陈代谢通路、泛酸盐和辅酶A的生物合成通路与扩张型心肌病相关通路，这些通路可能间接调控骨质疏松的病理过程，本研究结果可为后续动物体内体外实验、临床试验等进一步探索并验证lncRNA对骨质疏松发病的影响提供基础。

参考文献