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急性呼吸道感染（acute respiratory infections， ARI）是儿科最常见的呼吸系统疾病，ARI的发病率占儿童呼吸系统疾病首位[1-3]，据统计，5岁以下儿童每年发生的600万例死亡中有100万例是由ARI引起的[4-5]，给儿童的生长发育和身体健康带来了较大危害。许多病毒和细菌都能引起ARI，并且由于患者可能携带不止一种病原体，不同病毒之间以及病毒和细菌之间的临床体征相互重叠，往往使得仅基于临床表现的病因诊断变得困难，无法确定致病原因，导致抗生素治疗无效，造成抗生素滥用以及医源性交叉感染[6-7]，因此需要对呼吸道病原体进行快速检测，从而帮助诊断和准确用药。
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目前国内外对呼吸道病原体检测的方法较多，主要包括传统的分离培养方法、免疫学检测方法以及新兴的分子生物学检测方法[8-10]。病毒的分离培养及鉴定周期较长；免疫学方法在窗口期通常不能反映现症感染；单病原体的PCR方法检测通量较低。随着病原体分子诊断技术的不断提高，多重核酸扩增检测，已经被逐渐运用在临床检验过程中，它是一种速度快、灵敏性高、特异性强的检测方法，可以显著减少检测操作时间和成本，并且能够快速得到结果[11]。此外，多重核酸扩增检测能够提供多目标产物的共扩增，从而能够对呼吸道疾病混合感染的预后和复发提供重要信息。但是，目前通常使用的多重PCR检测试剂盒检测病原体的种类有限： Zhang等[12] 的研究只能检测大肠杆菌的各种亚型，不能检测多种病原体；刘晓萌等[13] 对肺炎常见病原菌的多重PCR检测，仅能检测肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌3种病原体。这一现状导致在快速鉴别病原体方面存在较大困难，不能及时指导临床治疗。
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本研究以儿童常见呼吸道病原体：肺炎支原体 （Mycoplasma pneumoniae，MP）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，S.au）、肺炎克雷伯菌（Klebsi⁃ ella pneumoniae，KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae， Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans，Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Aba）作为诊断目标，建立多重PCR结合毛细管电泳法检测体系，以提高儿童呼吸道感染诊断的效率。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，磁珠法病毒总核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司），毛细管电泳仪（Bioptic，江苏光鼎生物公司）。
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1.2 方法
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1.2.1 对象
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随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体临床检测剩余样本。
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1.2.2 痰液处理及核酸提取
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本研究创造性使用了一种高效核酸释放剂，使得细菌的细胞壁以及病毒的核衣壳充分破裂，核酸更加充分地释放出来。同时释放的核酸尤其是一些病毒的核酸是RNA，RNA非常不稳定，通过加入RNA酶抑制剂和RNA保护剂等，最大程度防止RNA的降解；又针对细菌核酸提取，在裂解液中加chelex⁃100提高核酸纯度。通过以上方式的优化，在痰液样本被充分液化的基础上，样本中的细菌或病毒被充分纯化，同时将后续核酸的提取时间从传统的柱膜法或磁珠法的30~60min缩短到仅需约8min，核酸释放量也是传统方法的两倍左右。
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1.2.3 引物设计、PCR扩增体系及条件建立
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我们利用相同的嵌合引物来设计特异引物，首先确定基本的PCR反应体系，进行单重PCR，筛选出最佳基因特异性引物浓度。按照上述引物浓度以及PCR促进剂浓度[四甲基氯化铵（TMAC）、甜菜碱、BSA、四甲基亚砜（TMSO）、海藻糖等]，进行了多重扩增体系的摸索，最终建立起一个7重扩增体系，分别包括肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、阴沟杆菌、白色假丝酵母菌、鲍曼不动杆菌。其引物设计如表1所示。扩增体系为50 μL：ddH2O 34.5 μL，10×Taq buffer 5 μL，dNTP Mix1μL，Primer Pool4.0 μL，模板5 μL，Taq酶0.5 μL。单重PCR扩增条件方案：95℃ 5min；95℃ 15s、55~60℃ 40s、72℃ 30s（10个循环）；95℃ 15s、 55~60℃ 30s、72℃ 30s（20个循环）；72℃ 5min。多重PCR扩增条件方案：95℃ 5min；95℃ 15s、 58℃40s、72℃ 30s（10个循环）；95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s（20个循环）；72℃ 5min。
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1.2.4 毛细管电泳检测
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取1 μL扩增后核酸样本，使用毛细管电泳仪对PCR扩增产物进行检测。
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1.2.5 临床样本检测
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采用上述建立方法检测266例临床检测剩余样本。
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2 结果
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2.1 7 种呼吸道病原体单重PCR产物毛细管电泳检测分析
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对7种呼吸道病原体：MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、 Cal、Aba分别进行单重PCR扩增，产物经毛细管电泳后均检测到相应片段，无明显的感染杂峰出现，引物设计合理（图1）。
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2.2 7 种呼吸道病原体多重PCR扩增结合毛细管电泳检测分析
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对7种呼吸道病原体逐步进行多重PCR扩增，调整扩增程序以及引物浓度，至无非特异性扩增条带，最终建立一个7种呼吸道病原体多重PCR扩增结合毛细管电泳的检测系统，该系统扩增产物进行毛细管电泳，均检测到对应片段，无明显杂峰出现（图2）。
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图1 7种呼吸道病原体单重PCR结合毛细管电泳检测结果
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2.3 临床样本检测结果
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对266例儿童呼吸道病原体痰液样本，进行7重PCR扩增并结合毛细管电泳分析，结果显示37例阳性，其中：8例肺炎支原体阳性（阳性率为3.0%），2例白色假丝酵母阳性（阳性率为0.8%），10例金黄色葡萄球菌阳性（阳性率为3.8%），8例肺炎克雷伯菌阳性（阳性率为3.0%），2例铜绿假单胞菌阳性（阳性率为0.8%），1例阴沟杆菌复合群阳性（阳性率为0.4%），3例鲍曼不动杆菌阳性（阳性率为1.1%）。该检测结果同痰培养以及实时荧光定量PCR（因肺炎支原体较难培养，故与实时荧光定量PCR结果作对比）比较，敏感性提高，多检测3例（表2）。
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图2 7种呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳检测结果
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2.4 多重PCR与单重PCR结合毛细管电泳检测的比较
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在266例儿童呼吸道病原体痰液标本中，随机选择100例，分别进行7种病原体的单重PCR扩增并结合毛细管电泳和多重PCR结合毛细管电泳检测分析，结果一致（表3）。
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3 讨论
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引起儿童ARI的病原体种类较多，涉及多种病毒和细菌，且临床症状表现相似，因此临床医生很难根据临床症状做出准确的病因诊断，如何快速准确地检测出患者所感染的呼吸道病原体一直是临床诊断面临的难点[14]。本研究建立了7种呼吸道病原体PCR扩增结合毛细管电泳分析的技术。
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这种检测方法可以一次性检测并区分多种呼吸道感染的病原体。本研究选取各种呼吸道感染病原体的保守序列进行PCR分析，在设计引物的同时注意不同病原体产物长度的差异化，以便于毛细管电泳的直观判断分析。阳性参考品经毛细管电泳检测，条带长度与设计长度基本一致，未出现明显非特异性检测峰；利用此方法检测了2020年11— 12月随机收集的266例儿童呼吸道病原体痰液样本，各病原体的检出率高于痰培养及实时荧光定量PCR，且检测时间远远短于细菌培养，能够满足临床实验室诊断的需求。除此之外，本研究在266例上述标本中，随机选取100例标本，进行7种病原体单重PCR结合毛细管电泳检测，该结果与多重PCR结果完全一致，进一步佐证了多重PCR结合毛细管电泳检测技术的可靠性。
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多重PCR结合毛细管电泳检测，在发挥毛细管电泳检测技术优势的前提下，最大程度降低检测成本，提高检测效率[15]，未来该技术值得在临床大范围推广和应用。
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摘要
目的：建立肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、肺炎克雷伯菌 （Klebsiella pneumoniae，KP）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.Ae）、阴沟杆菌（Enterobacter cloacae，Ecl）、白色假丝酵母菌（Candida albicans，Cal）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Aba）7种儿童呼吸道病原体多重PCR结合毛细管电泳法检测体系。方法：随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266例儿童呼吸道病原体样本，针对MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、Cal、 Aba保守序列设计特异性引物，设计并优化多重PCR结合毛细管电泳检测体系；将该检测结果与细菌培养以及荧光定量PCR 比对，评估该方法的检测性能（灵敏度、特异度）。结果：所设计引物可以特异性扩增出呼吸道病原体；多重PCR结合毛细管电泳检测体系检出敏感性高；与其他呼吸道感染病原体未出现交叉反应，无明显的非特异峰，特异性较好。结论：成功建立一种能够快速筛查7种常见儿童呼吸道病原体的多重PCR结合毛细管电泳的检测方法。