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糖尿病严重危害人类健康，往往合并心、脑、肾、视网膜等脏器和组织的并发症，其中以冠状动脉病变尤为严重，可导致心肌梗死、恶性心律失常和心脏猝死等严重并发症，已成为我国急性心肌梗死的最主要危险因素之一[1]。大电导钙激活钾通道 （BK通道）广泛分布于冠状动脉平滑肌细胞上，由4个 α亚基和4个β亚基组成，其中α亚基形成BK通道的孔区，β亚基为辅助亚基，对BK通道动力学起重要调节作用。在血管平滑肌细胞上，主要为β1亚基，参与血管张力调节，对冠状动脉血管舒张收缩功能起重要调节作用[2-3]。高血糖可上调超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平，SOD抑制过氧化氢酶表达，导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）显著增加，糖尿病患者体内ROS增高是糖尿病患者的普遍特征。ROS是BK通道的强力抑制剂，使BK通道的生理功能障碍，本课题组以前的研究证实，在糖尿病合并冠心病患者的冠状动脉平滑肌细胞中BK⁃β1降低，BK通道功能障碍[4]。最近的研究表明，细胞氧化应激反应的核因子E2相关因子2（Nrf2）可能参与BK通道的调节，并可能与E3泛素连接酶引起的BK⁃β1的分解代谢加快，BK⁃β1降低有关[5-6]。
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DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNA⁃Pkcs） 属于磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（PI3K）超家族，与蛋白激酶B（Akt）的473丝氨酸（S473）的磷酸化（p⁃Akt）有关[7]。以前的研究表明，ROS能激活细胞内DNA⁃ Pkcs和PI3K/Akt信号传导通路，调节细胞的生长、分化及细胞凋亡[8-9]。本研究探讨糖尿病中PI3K/Akt信号传导通路是否参与冠状动脉平滑肌细胞中BK⁃β1的调节。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary ar⁃ tery smooth muscle cell，HCASMC，中科院上海细胞研究所），HCASMC培养基SMBM（Lonza Walkers⁃ ville公司，美国），ROS检测试剂盒、二甲基亚砜 （DMSO）、PI3K抑制剂Wortmannin（上海碧云天公司），ROS抑制剂GKT137831（SELLECK公司，美国）。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司，美国）。抗BK⁃a抗体（Alomona公司，以色列），抗BK⁃β 1抗体（Abcam公司，美国），DNA ⁃Pkcs、Akt、p ⁃Akt （S473）（Santa Cruz公司，美国）。SPF级Spraque Dawley 8~12周龄的雄性大鼠30只（江苏省血吸虫病防治研究所动物中心），体质量（200±30）g。本研究方案经南京医科大学实验动物伦理委员会批准，实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明。
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1.2 方法
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1.2.1 HCASMC的处理
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HCASMC培养于SMBM培养基，正常糖浓度培养基及高糖浓度培养基葡萄糖浓度分别为5mmon/L及15mmon/L。PI3K抑制剂Wortmannin处理组以不含血清的SMBM培养基加入Wortmannin（100nmon/L） 预处理细胞30min，再以高糖浓度培养基培养48h （n=3），对照组以终浓度0.1%（w/w）的二甲基亚砜 （DMSO）的无血清培养基预处理细胞30min，再以高糖浓度培养基培养48h（n=3）。ROS抑制剂GKT137831处理组以GKT137831（20 μmon/L）加入高糖浓度培养的HCASMC作用48h（n=3），对照组以终浓度0.1%（w/w）的二甲基亚砜（DMSO）作用于高糖浓度培养的人平滑肌细胞（n=3）。用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，加入RIPA裂解液，在冰上充分裂解，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。
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1.2.2 糖尿病大鼠动物模型的建立及处理
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20只大鼠采用STZ 60mg/kg腹腔内注射，2周后测定大鼠血糖浓度，如血糖浓度低于300mg/dL，则用等剂量STZ再次腹腔内注射，持续8周血糖浓度高于300mg/dL诊断为糖尿病。10只大鼠腹腔内注射生理盐水作为正常对照组（Nor，n=10）。20只糖尿病大鼠中，10只以GKT137831[40mg/（kg·d）] 灌胃2周（DM+GKT，n=10），10只糖尿病大鼠灌胃相同数量的饮用水2周（DM，n=10），处死大鼠。分离正常大鼠、糖尿病大鼠及经GKT137831灌胃的糖尿病大鼠冠状动脉，冠状动脉分离方法在课题组相关文献中已有详述[6]。简言之，处死的大鼠酒精消毒后，切开大鼠胸腔，将大鼠心脏连同出入心脏的大血管切下，将切下的心血管组织浸入冰冷的缓冲液中 （NaCl 145mmol/L、KCl 4.0mmol/L、CaCl20.05mmol/L、 MgCl2 1.0mmol/L、HEPES 10mmol/L、Glucose 10mmol/L，pH7.20），在外科手术显微镜下使用显微手术器械，自大鼠主动脉根部冠状动脉起始部，沿左侧及右侧冠状动脉走行途径，细微分离右冠状动脉及左冠状动脉。冠状动脉血管组织用液氮速冻后储存于-80℃备用。将动脉组织匀浆化，收集总蛋白。
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1.2.3 HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中ROS检测
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用细胞渗透荧光探针DCFHDA检测人HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中的ROS及GKT137831对ROS的影响。HCASMC在5mmon/L糖浓度（NG组， n=3）、15mmon/L糖浓度（HG组，n=3）、15mmon/L糖浓度+GKT137831（HG+GKT组，n=3）孵育48h后，用PBS洗涤2次，然后加入DCFHDA 10 μL和90 μL无血清SMBM培养基37℃培养30min，孵育后用PBS洗涤2次，荧光显微镜480~525nm检测DCF荧光强度。快速冰冻的大鼠冠状动脉血管环被切割成30 μm厚的切片，并放置在玻璃玻片上（DM，n=3；DM+GKT， n=3）。DCFH⁃DA（25 μmon/L）应用于组织切片，37℃ 避光孵育30min，荧光显微镜480~525nm检测DCF荧光强度，将使用Scion Image软件对DCF信号进行进一步的密度分析。
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1.2.4 采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测HCASMC及大鼠冠状动脉BK⁃a亚基、BK⁃β1亚基、DNA⁃Pkcs、 Akt、p⁃Akt（S473）表达
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等量蛋白分别行8％~12％丙烯酰胺凝胶电泳， 5％脱脂牛奶室温封闭1h，一抗4℃封闭过夜，洗膜， HRP标记二抗室温封闭2h。洗膜后再用GAPDH抗血清封闭，ECL试剂盒发光，吸光度分析法定量。
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1.3 统计学方法
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以SPSS 11.5统计分析软件进行分析，计量资料以均数士标准差（ ± s）表示。采用t检验对正常组和糖尿病组BK ⁃ a、BK ⁃β1、DNA ⁃ Pkcs、Akt、p ⁃Akt（S473）蛋白表达进行比较，P< 0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 不同糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃ Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
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与5mmol/L葡萄糖浓度下的HCASMC比较， 15mmol/L葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α表达无明显变化，BK ⁃β1蛋白表达降低（P< 0.05），DNA ⁃ Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达增高（P< 0.05，图1）。
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2.2 Wortmannin处理HCASMC后BK ⁃ β1、DNA ⁃ Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
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HCASMC以Wortmannin（100nmol/L）预处理30min后，在15mmol/L葡萄糖浓度的SMBM中培养48h并和对照组相比较，Wortmannin处理组，DNA⁃ Pkcs、Akt的表达无明显变化（P> 0.05），p⁃Akt蛋白表达量明显降低，BK ⁃β1的表达量明显增高（P< 0.05，图2）。
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2.3 GKT137831 作用于15 mmol/L糖浓度下的HCASMC 48 h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
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与15mmol/L糖浓度下的HCASMC比较，15mmol/L糖浓度下HCASMC经GKT137831处理48h后，DNA ⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt蛋白表达降低（P< 0.05），BK⁃β1表达量增高（P< 0.05，图3）。
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图1 Western blot检测不同葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃PKcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达
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Fig.1 Expression of BK⁃α，BK⁃β1，DNA⁃PKcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells in different glucose concentrations by Western blot
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图2 Western blot检测Wortmannin作用于HCASMC后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）的表达
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Fig.2 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt（S473）of human coronary artery smooth muscle cells treated with Wortmannin by Western blot
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图3 Western blot检测GKT137831作用HCASMC 48h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
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Fig.3 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt （S473）of human coronary artery smooth mus⁃ cle cells after treated with ROS inhibitor GKT137831for 48h by Western blot
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2.4 GKT137831 对HCASMC及大鼠冠状动脉中ROS的影响
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DCFH⁃DA进入细胞，容易被细胞内酯水解将ES转化为非荧光形式的DCFH，在多种ROS存在下迅速转化为荧光DCF。15mmol/L葡萄糖浓度下的HCASMC中ROS明显高于5mmol/L葡萄糖浓度 （P< 0.05）。经GKT137831处理48h后，和15mmol/L葡萄糖浓度组相比，GKT137831处理后的HCASMC中ROS含量降低约40%（P< 0.05）。STZ诱导的糖尿病大鼠经GKT137831灌胃2周后，冠状动脉中ROS含量较未经GKT137831处理组降低40%（P< 0.05，图4）。
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2.5 大鼠冠状动脉BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
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和正常大鼠相比较，STZ糖尿病模型大鼠冠状动脉DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）表达量分别增加约50%、30%、30%（P< 0.05），BK⁃β1表达量降低约45%（P< 0.05）；和糖尿病大鼠相比较，GKT137831喂饲2周后的糖尿病大鼠冠状动脉DNA⁃Pkcs、Akt、 p⁃Akt（S473）蛋白表达量明显降低（P< 0.05）、BK⁃β1表达量明显增高接近于正常大鼠水平（P< 0.05，图5）。
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图4 GKT137831对HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉ROS的影响
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Fig.4 ROS Expression of human coronary artery smooth muscle cells and coronary artery from STZ induced diabetic rats treated with GKT137831
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3 讨论
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BK通道是大电导钙激活钾通道的一种，广泛存在于人体的组织细胞和血管平滑肌细胞中，BK通道调节着血管张力，与血管的血流有关。BK通道电流约占冠状动脉平滑肌细胞总钾离子电流的65％，是冠状动脉平滑肌细胞上最主要的钾通道，在糖尿病等疾病状态下，冠状动脉平滑肌细胞BK通道开放减少，电流密度降低，蛋白表达减弱，BK通道功能障碍，可能是冠状动脉功能受损的最主要原因[10]，因此，积极寻求糖尿病状态下BK通道蛋白表达减少及功能障碍的原因，对糖尿病状态下冠状动脉疾病的防治，具有重大临床意义。
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高糖状态可上调SOD的水平，导致细胞内ROS显著增加。超氧阴离子自由基和NO反应产生的过氧化亚硝基（OONO-）可抑制大鼠大脑动脉血管平滑肌细胞膜上的BK通道[11]。本课题组以前的研究证实，高糖（22mmol/L）状态下，转染表达钙激活钾离子通道（hSlo）的HEK293细胞及HCASMC中，BK通道电流密度下降，通道激活和失活动力学减慢。 ROS是BK通道的强力抑制剂，使BK通道的生理性激活功能丧失，并且这种抑制效能与敲除BK通道的β1亚基相同[4]。本研究中为进一步探讨ROS是否为高糖状态下HCASMC中BK⁃β1表达降低的触发因素，测定了高糖浓度下HCASMC和糖尿病大鼠模型冠状动脉中ROS水平，证实高糖浓度下HCASMC和糖尿病大鼠模型冠状动脉中ROS表达量增高。将ROS抑制剂GKT137831作用于高糖培养的HCASMC发现，HCASMC中BK⁃β1表达增高，提示高糖状态下的ROS可能参与了HCASMC中BK ⁃β1蛋白调节。
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图5 Western blot检测GKT137831对糖尿病大鼠冠状动脉的BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）的影响
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Fig.5 Expression of BK⁃β1，DNA⁃Pkcs，Akt and p⁃Akt （S473）of coronary artery from STZ induced di⁃ abetic rats treated with GKT137831by West⁃ ern blot
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大量研究证据表明，氧化应激时PI3K/Akt信号通路被激活并通过核因子E2相关转录因子2（Nrf2） 激活下游抗氧化基因的表达[12-13]。为了探讨高糖是否通过PI3K/Akt通路影响BK⁃β1的表达，在高糖培养的HCASMC中发现，BK⁃β1表达明显减少的同时伴有DNA ⁃ Pkcs、Akt及p ⁃ Akt的表达增高。经GKT137831作用后的HCASMC中DNA⁃Pkcs、Akt、 p ⁃ Akt表达量降低，以PI3K抑制剂Wortmannin （100nmol/L）预处理细胞后，高糖状态下的HCASMC DNA⁃Pkcs、Akt未见明显变化，p⁃Akt的表达明显降低，BK⁃β1表达明显增加。提示高糖状态下， ROS可能通过PI3K/AKT通路参与BK⁃β1的调节。
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为了进一步验证糖尿病中ROS对冠状动脉平滑肌细胞BK⁃β1的调节作用，在STZ诱导的糖尿病大鼠中发现，糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞ROS、DNA⁃Pkcs、Akt及p⁃Akt表达增高，BK⁃β1的表达量降低。GKT137831灌胃2周后的糖尿病大鼠中冠状动脉平滑肌细胞ROS表达量降低，DNA⁃PKcs、 Akt、p⁃Akt、BK⁃β1蛋白表达量接近于正常大鼠水平，进一步验证在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞中，ROS通过PI3K/AKT信号通路调节BK⁃β1亚基的代谢。
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糖尿病中调节BK通道功能和代谢的因素较多，已有的研究结果证实，二十二碳六烯酸调节BK通道的电流和冠状动脉血管张力[14]。Nrf2、MuF1通过泛素化降解途径影响BK⁃β1的分解代谢[6]。本研究结果显示，糖尿病中ROS可能通过PI3K/AKT信号通路部分参与冠状动脉平滑肌细胞BK⁃β1的调节。本研究初步探讨了糖尿病中ROS对BK⁃β1调节的可能机制，局限于ROS对BK⁃β1蛋白表达量的研究，ROS对冠状动脉平滑肌细胞BK通道电流的影响以及对冠状动脉血管张力的影响尚有待进一步研究。
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摘要
目的：探讨PI3K/Akt对糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调节作用。方法：采用正常糖浓度（5 mmon/L）、高糖浓度（15 mmon/L）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）抑制剂GKT137831、PI3K抑制剂Wortmannin作用于人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary artery smooth muscle cell，HCASMC）。以GKT137831喂饲链脲霉素（streptozocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠， 免疫印迹测定HCASMC、大鼠冠状动脉PI3K超家族DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）及BK⁃α亚基、BK⁃β1亚基的表达，2’，7’⁃二氯二氢荧光素二乙酸酯测定HCASMC及大鼠冠状动脉ROS表达。结果：高糖浓度下HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉ROS、DNA ⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）表达量增高，BK⁃β1表达量降低（P < 0.05）。GKT137831作用后的HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中， ROS、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt（S473）表达量降低，BK⁃β1 表达量明显增高（P < 0.05）。Wortmannin 作用后的 HCASMC p⁃Akt （S473）表达量降低，BK⁃β1表达量明显增加（P < 0.05）。结论：PI3K/Akt通路参与糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的调控。
Abstract
Objective：This study aims to investigate the effect of PI3K/Akt pathway on the regulation of large conductance Ca2 + ⁃ activated K+ channel（BK channel）in diabetic coronary smooth muscle cells. Methods：Human coronary artery smooth muscle cells （HCASMC）were incubated with different concentrations of glucose（5 mmol/Land 15 mmol/L），reactive oxygen species（ROS） inhibitor GKT137831 and PI3K inhibitor wortmannin. Streptozotocin ⁃ induced diabetic rats were established successfully by intraperitoneal injection. Expression of DNA ⁃ Pkcs，Akt，p ⁃ Akt（S473），BK ⁃ α subunit and BK ⁃ β1 subunits were determined by Western blot. ROS generation in HCASMC was measured in terms of fluorescence using the cell⁃permeable fluorogenic probe DCFH⁃ DA. Results：Compared with that of HCASMC incubated in 5 mmon/L glucose concentration，the expression of DNA⁃Pkcs，Akt，p⁃Akt （S473）increased significantly and BK⁃β1 subunit decreased significantly（P < 0.05）. Compared with the control group，the expression of p ⁃Akt（s473）decreased significantly（P < 0.05）and BK ⁃β1 increased significantly（P < 0.05）after pretreated with Wortmannin. Conclusion：PI3K/Akt channel is involved in the regulation of BK channel expression in diabetic coronary smooth muscle cells.
关键词
糖尿病 ； 大电导钙激活钾通道β1亚基 ； 冠状血管