血流感染是一类严重的感染性疾病，其病情发展迅速、病死率高^[1]。及时有效的抗生素使用是治疗血流感染的关键，研究表明血流感染患者抗生素治疗每延迟1h，其平均存活率降低7.6%^[2]。血培养是诊断血流感染的金标准^[3]，血培养病原菌若能快速鉴定，则对于指导临床用药、降低患者死亡率有重要意义。传统血培养病原菌鉴定在血培养仪阳性报警后一般需要18~24h，甚至更长时间，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix⁃assisted la⁃ ser desorption ionization⁃time of flight mass spectrome⁃ try，MALDI⁃TOF MS）作为一种新型的微生物鉴定技术，对纯菌落鉴定可在6min内完成^[4]，具有快速、准确的特点，有学者将此技术应用于阳性血培养直接鉴定，极大地缩短了鉴定时间^[2，4-6]。本研究利用基于分离胶的两种前处理方法联合MALDI⁃ TOF MS直接鉴定血培养阳性病原菌，比较其与培养鉴定结果的一致性，旨在为临床早期目标性治疗提供快速可靠的病原学依据，并为本实验室血培养病原菌快速鉴定寻找合适的前处理方法。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2020年5—11月南京医科大学第一附属医院血培养阳性标本302例。纳入标准：①直接镜检发现病原菌；②同一患者同时送检的多个血培养瓶选择最早报阳的阳性瓶。

BACTEC TM FX血培养系统、血培养瓶和5mL注射器（BD公司，美国）；VITEK MS质谱仪及其配套试剂、大肠埃希菌ATCC 8739和VITEK 2⁃Compact全自动微生物鉴定系统及配套试剂（梅里埃公司，法国）；血平板、巧克力平板（郑州安图公司）；真空采血管（血清分离管）（Greiner公司，德国）；甲酸、乙腈和皂甙（Sigma⁃Aldrich公司，美国）；75%乙醇（兴化市医疗卫生用品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分离胶⁃皂甙法

当血培养仪提示阳性报警时，取出阳性瓶进行革兰染色，确保镜下有菌，颠倒混匀血培养瓶，用无菌注射器抽取4mL阳性血培养液至含分离胶的真空采血管内，室温3 500r/min离心10min，弃上清后加入1mL无菌去离子水，混匀并转移至1.5mL EP管内，16 000 g离心1min，弃上清后加入980 μL无菌去离子水和20 μL 0.5%的皂甙混匀后静置5min， 16 000 g离心1min，再次弃上清后加入75%乙醇混匀，16 000 g离心2min，弃上清，待乙醇挥发后加入50 μL 70%的甲酸，震荡10min后加入50 μL乙腈，继续震荡10min，最后16 000 g 离心1min，取1 μL上清液点样至金属靶板，干燥后加入基质液，干燥的靶板使用VITEK MS进行快速鉴定。

1.2.2 分离胶沉淀法

当血培养仪提示阳性报警时，取出阳性瓶进行革兰染色，确保镜下有菌，颠倒混匀血培养瓶，用无菌注射器抽取4mL阳性血培养液至含分离胶的真空采血管内，室温3 500r/min离心10min，弃上清后加入1mL无菌去离子水，小心混匀白色菌膜并转移至1.5mL EP管内，16 000 g离心1min，弃上清及肉眼可见的血细胞杂质，加入75%乙醇混匀，16 000 g 离心2min，弃上清，待乙醇挥发后加入20 μL无菌去离子水混匀沉淀，取0.5 μL沉淀至金属靶板，革兰阴性菌直接加基质液，革兰阳性菌及真菌加入仪器配套的40%甲酸待干燥后加入基质液，干燥的靶板使用VITEK MS进行快速鉴定。

1.2.3 血培养阳性标本常规鉴定

当血培养仪提示阳性报警时，取出阳性瓶进行革兰染色并转种至相应平板孵育18~24h，分离出单个菌落，挑取单个菌落，点样至金属靶板，革兰阴性菌直接加基质液，革兰阳性菌及真菌加入仪器配套的40%甲酸待干燥后加入基质液，干燥的靶板使用VITEK MS进行常规鉴定。

1.2.4 结果判读

通过VITEK MS的MYLA服务器进行结果判读，绿色表示鉴定可信度为60.0%~99.9%，只有1个鉴定结果，记录鉴定结果；黄色表示表示鉴定可信度为>60%，有2种或2种以上鉴定结果，分别记录鉴定结果；红色表示鉴定可信度为<60%，无鉴定结果，鉴定失败，以分离出的单个菌落常规质谱鉴定结果为金标准。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料以例数（百分比）[n（%）]表示。率的比较采用χ² 检验进行分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种前处理方法鉴定单数菌感染标本结果比较

302例阳性血培养标本经培养确认后，共有单数菌感染标本288例，使用分离胶⁃皂甙法联合MALDI⁃TOF MS直接鉴定血培养病原菌一般需要45min，分离胶沉淀法一般需要20min。两种方法联合MALDI⁃TOF MS直接鉴定需/厌氧瓶内病原菌结果见表1，分别及同时使用两种方法鉴定需氧瓶内病原菌的准确率均高于厌氧瓶，但差异无统计学意义（P> 0.05），不同类型培养瓶中两种方法鉴定的准确率差异也无统计学意义（P> 0.05）。

2.1.1 两种前处理方法直接鉴定革兰阳性球菌结果比较

革兰阳性球菌中不同细菌直接鉴定结果见表2。直接鉴定革兰阳性球菌的准确率为同时使用两种方法>分离胶⁃皂甙法>分离胶沉淀法，三者准确率无统计学差异（P> 0.05）。两种方法对葡萄球菌及肠球菌鉴定的准确率均显著高于链球菌及其他少见革兰阳性球菌，差异有统计学意义（P< 0.05）。分离胶⁃皂甙法在种水平未有鉴定错误的情况发生，分离胶沉淀法有1例麻疹孪生球菌鉴定错误为溶血孪生球菌。

2.1.2 两种前处理方法直接鉴定革兰阴性杆菌结果比较

革兰阴性杆菌中不同细菌的鉴定结果见表3。直接鉴定革兰阴性杆菌的准确率为联合两种方法=分离胶沉淀法>分离胶⁃皂甙法，三者准确率无统计学差异（P> 0.05）。两种前处理方法对革兰阴性杆菌鉴定的准确率均高于革兰阳性球菌，其中分离胶沉淀法两者之间有显著差异（P=0.005）。分离胶⁃皂甙法中有2例阴沟/阿氏肠杆菌被鉴定错误为阴沟/阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌混合感染。分离胶沉淀法中有1例阴沟/阿氏肠杆菌鉴定错误为霍氏肠杆菌，有1例沙门菌可直接准确鉴定为肠炎沙门菌。

由于方法学限制，VITEK MS无法区分阴沟肠杆菌及阿氏肠杆菌，故仪器鉴定出此两种菌认为鉴定正确。

2.1.3 两种前处理方法直接鉴定革兰阳性杆菌及真菌结果比较

联合两种方法直接鉴定革兰阳性杆菌及真菌的准确率与分离胶⁃皂甙法和分离胶沉淀法相比，差异无统计学意义（P> 0.05）。两种前处理方法鉴定革兰阳性杆菌及真菌的准确率普遍较低，与革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌相比，其鉴定准确率差异有统计学意义（P< 0.05，表4）。

2.2 两种前处理方法直接鉴定复数菌感染标本结果比较

302例阳性血培养标本中共有复数菌感染标本14例，包括2种革兰阴性杆菌混合感染9例、2种革兰阳性球菌混合感染3例、革兰阳性球菌和阴性杆菌混合感染1例和革兰阳性球菌和真菌混合感染1例。分离胶⁃皂甙法中仅有1例肺炎克雷伯菌与鲍曼不动杆菌混合感染完全鉴定正确，其余13例均只能正确鉴定出其中一种细菌；分离胶沉淀法中14例均只能正确鉴定出其中的1种细菌，同时使用两种方法后共有3例混合感染标本完全鉴定正确。

3 讨论

利用MALDI⁃TOF MS技术直接鉴定血培养阳性病原菌近来已成为国内外研究的热点^[2，5]，由于阳性血培养瓶中血红蛋白及其他成分可影响MALDI⁃ TOF MS指纹图谱，干扰病原菌鉴定，阳性血培养瓶必须经前处理使病原菌富集纯化后才能进行质谱直接鉴定^[4，7]。阳性血培养瓶前处理方法众多，主要基于去污剂选择裂解法、渗透压选择裂解法、分离胶分离法、差速离心法和滤膜过滤法等原理富集病原体，各方法均有优势和不足，尚无标准的前处理方法^[4，8]。德国布鲁克的Sepsitype试剂盒法是一种利用去污剂选择性裂解血细胞集菌的商品化方法，操作简单，但成本较高^[5]；上海地区推荐使用分离胶促凝管处理血培养阳性标本^[9]；也有基于上述原理的实验室自建方法报道^[2]，临床实验室可根据自身情况选择合适的前处理方法。另外，由于血培养瓶前处理后仍存在少量杂质干扰微生物的质谱峰，利用质谱仪直接鉴定血培养阳性病原菌时应降低质谱评分标准，以提高鉴定准确率^[10]。

本实验室利用现有资源采用基于分离胶的两种前处理方法，并将鉴定结果可信度>60%的结果认为鉴定到种水平。分离胶沉淀法与其他报道的分离胶方法相比，无需蛋白提取步骤^[10-11]，可在20min内完成鉴定，但在操作过程中需去除肉眼可见的血细胞杂质，对人员操作要求较高；分离胶⁃皂甙法与分离胶沉淀法相比，增加了皂甙洗涤和蛋白提取步骤，对人员没有特殊要求，一般需要45min完成鉴定。两种前处理方法在288例单数菌感染标本中直接鉴定的准确率均为86.81%，略高于其他分离胶法 （84.09%）^[10]，且在属水平未有鉴定错误的情况发生，鉴定结果可靠。对于血流感染常见菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌及肠球菌属两前处理方法准确率极高（>90%）。另外，对于需/厌氧瓶中的病原菌两前处理方法鉴定的准确率差异无统计学意义，均可进行不同血培养瓶病原菌的直接鉴定，且在1h内完成，满足临床需求。相对而言，分离胶⁃皂苷法对革兰阳性菌的准确率高于分离胶沉淀法，对革兰阴性菌及真菌的准确率低于分离胶沉淀法，但并无统计学差异，故推荐分离胶沉淀法作为本实验室血培养快速鉴定常规的前处理方法。同时使用两种前处理方法时，病原菌鉴定的准确率提高，尽管和单一前处理方法相比差异没有统计学意义，但对于单个感染标本而言，可增加病原菌的检出率和准确率，减少实验误差。

两种方法联合质谱直接鉴定血培养革兰阴性杆菌的准确率高于革兰阳性菌，与文献报道类似^{[5-8，10，12]}。其中分离胶沉淀法直接鉴定革兰阴性杆菌的准确率明显高于革兰阳性球菌，提示该法更适用于革兰阴性杆菌血流感染的直接鉴定；分离胶⁃ 皂甙法两者之间差异并无统计学意义，可能是由于增加了破壁及蛋白提取步骤。革兰阳性菌中链球菌、少见革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌鉴定率显著低于肠球菌、葡萄球菌，可能与质谱仪相应菌株库差异有关，另外病原菌生长缓慢，达不到质谱检测限可能也是原因之一，有学者建议通过短时液相或固相培养可提高此类细菌鉴定的准确率^[13]。质谱直接鉴定血培养真菌的检出率普遍较低^[5]，王岩等^[6] 分析可能是由于真菌本身细胞壁结构特殊，核蛋白未能释放；另外有些菌株缺乏特异性峰值或峰值数量不足从而无鉴定结果。本研究真菌的检出率低于文献报道^[5-6]，可能与前处理时吸取液体的量及离心机转速有关，导致富集的真菌量少，无法达到质谱的最低检测限^[14]，另外真菌细胞壁利用本文前处理方法破壁效果不佳，文献报道增加前处理培养液的量，并在离心、洗涤过程中加入吐温⁃20、玻璃珠等操作可将真菌检出率提高至90%^[2]。后期本实验室将针对革兰阳性杆菌、真菌等直接鉴定准确率低的血培养阳性病原菌摸索合适的血培养前处理方法。

14 例复数菌感染标本中，仅分离胶⁃皂甙法有1 例完全鉴定正确，但两种方法均能正确鉴定出其中1 种菌，可能与MALDI⁃TOF MS本身就不适宜作复数菌感染的鉴定有关^[13]，并且复数菌感染中菌量不同，质谱只能鉴定出其中含量较高的一种^[5]。本研究复数菌感染标本中，两种前处理方法出现鉴定结果不一致的情况，后证实均为复数菌感染菌中的一种。表明联合此两种前处理方法可提高复数菌感染的检出率，当然，此结论还有待进一步研究证实。

综上所述，基于分离胶的两种阳性血培养瓶前处理方法联合MALDI⁃TOF MS均可直接、快速、准确地鉴定血培养病原菌，可行性强，在不增加成本的情况下，利用实验室现有资源，缩短血培养阳性病原菌鉴定时间，为血流感染目标性治疗节省宝贵时间。分离胶沉淀法步骤简单，可作为本实验室血培养快速鉴定常规的前处理方法，真菌及革兰阳性杆菌的血培养前处理方法还有待进一步研究。

参考文献