结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，全球每年新增140万例，发病率居所有肿瘤第3位^[1]。超过50%的结直肠癌患者在诊断时已错失手术机会，预后欠佳，而伴有远处转移的晚期结直肠癌患者其5年生存率低于10%^[2]。因此，寻找有效的分子靶点为结直肠癌患者早期诊疗提供依据，对提高患者的预后至关重要。

基于肿瘤糖酵解旺盛的特点，¹⁸氟⁃脱氧葡萄糖 （¹⁸F⁃fluorodeoxyglucose，¹⁸F⁃FDG）正电子发射型计算机断层扫描（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）广泛应用于许多恶性肿瘤诊断、分期、疗效监测及预后分析^[3]。摄取葡萄糖是糖酵解的第一个步骤，葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）在多种肿瘤细胞中高表达，控制着葡萄糖的摄入^[4]，但GLUT1表达增高机制尚不完全清楚。沉默调节蛋白5（Sirtuin 5，SIRT5）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的赖氨酸去酰化修饰酶^[5]。 SIRT5可以通过其去乙酰化、去丙二酰化、去琥珀酰化、去戊二酰化等修饰影响多种葡萄糖代谢过程中的关键酶，进而促进肿瘤细胞糖酵解^[6]。据报道，肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中SIRT5mRNA或蛋白表达明显升高，提示SIRT5在某些方面可能具有潜在的促肿瘤作用^[5]。但SIRT5在结直肠癌糖酵解中的作用及其潜在机制尚无定论。据此，本研究拟分析结直肠癌患者SIRT5与 ¹⁸F⁃FDG PET/CT显像、GLUT1表达和患者预后的关系，并进一步探讨可能存在的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

回顾性收集2015年12月—2020年12月在南京市第一医院和江苏大学附属医院外科行手术治疗的结直肠癌患者共78例。所有患者均经术后病理明确诊断为原发性结直肠癌；结直肠癌组织及对应的正常癌旁组织齐全；术前未进行任何放、化疗及其他辅助治疗；患者均有完整的临床资料，包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况、TNM分期；患者术后随防至2021年5月，随访时间6~65个月。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情并签署同意书。

DLD1、HT⁃29细胞（人结直肠癌细胞系，中国科学院），用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，添加100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素，置于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中。

1.2 方法

1.2.1 ¹⁸F⁃FDG PET/CT检查

受检者检查前空腹至少6h，检查前控制患者血糖正常。按照0.05~0.10mCi/kg静脉注射 ¹⁸F ⁃FDG （南京江原安迪科公司），静息60min排空尿液后使用联影Umi780PET/CT扫描仪或Siemens超高清Biograph mCT xPET/CT扫描仪进行扫描。扫描范围：颅顶至大腿根部。扫描参数：CT扫描（120kV， 200mA，螺距0.987 5mm，旋转时间0.5s，层厚3mm，间隔1.5mm），PET采集（3min/床位、采集4个床位、床位重叠26%）。CT数据进行衰减校正，采用自适应滤波函数及2次迭代重建法，处理重建图像。在横轴位融合图像上使用软件自动勾画感兴趣区三维体积，计算得出最大标准化摄取值（maximal standard uptake value，SUVmax）。由2位高年资核医学医师独立阅片，结果有分歧时经讨论得出统一结论。

1.2.2 免疫组化染色

10％福尔马林液固定的石蜡切片（厚度5 μm），常规脱蜡和水化后，PBS冲洗3次，再用0.01mol/L枸橼酸盐抗原修复液（pH值6.0）进行抗原热修复 （微波法）。 SIRT5抗体（Abcam公司，英国）及GLUT1抗体（Abcam公司，英国）孵育后，辣根过氧化物酶标记二抗（上海CST公司）孵育，DBA染色，苏木素染料复染，脱水，透明，封片。由2位有经验的病理学医师独立分析。按染色强度进行评分（评分标准：0=未染色，1=黄色，2=浅褐色，3=深棕色；分值0~1分为低表达，2~3分为高表达）。

1.2.3 CRISPR/Cas 9基因编辑敲除（knock⁃out，KO） SIRT5基因

设计SIRT5⁃KO引物。正向序列：5′ ⁃CACCGGCTGGGAAATCAATCGACTT ⁃ 3′；反向序列：5′ ⁃ AAACAAGTCGATTGATTTCCCAGCC ⁃ 3′。KO引物退火后与Lenti⁃CRISPRv2载体连接，转化DH5α细菌，涂于LB平板上生长14h，挑单克隆入LB培养基转移到摇床摇动30min，送公司测序验证。验证正确的KO质粒与病毒包装质粒gag和wvg一起转染HEK293T细胞，48h后收集培养液感染细胞，同时加2 μL Polybrene（×1 000），感染48h后，加2g/L puromycin筛选感染细胞。筛选2周后，鉴定细胞KO效率。

1.2.4 荧光素酶报告基因检测

将细胞接种到6孔板上，报告质粒（p2.1）和对照质粒（pSV40⁃Renilla）转染24h，然后在20%的氧气下暴露24h。按照双荧光素酶检测试剂盒说明书 （Promega公司，美国）对细胞提取物进行分析。p2.1与pSV40⁃Renilla荧光强度的比率代表缺氧诱导因子1α（hypoxia⁃inducible factor 1α，HIF1α）的转录活性。

1.2.5 免疫荧光检测

单层细胞在24孔板内的爬片上生长，弃培养液后，PBS清洗3次，3%~4%多聚甲醛固定，每孔用200 μL含0.25%Triton X⁃100的PBS清洗3次，200 μL含1%BSA的PBST，摇床上室温封闭30min；弃上清，加入合适浓度的一抗，摇床上室温孵育1h，PBS清洗3次后加入合适浓度的荧光二抗，摇床上室温避光孵育1h；PBS清洗3次后加入DAPI，室温静置2min；封片胶将其固定在载玻片上，荧光显微镜下观察。

1.2.6 细胞¹⁸F⁃FDG摄取和乳酸的测定

¹⁸F⁃FDG摄取测定：12孔板每孔铺1×10⁵ 个细胞，用2 μCi/mL的¹⁸F⁃FDG无糖培养基1mL培养1h，弃培养基，PBS清洗细胞2次，用0.1mol/L NaOH溶液1mL裂解细胞，转移至γ计数管检查。乳酸检测：吸取4 μL细胞裂解液加入酶标板中，加入200 μL乳酸检测工作液，37℃避光孵育10min；用酶联免疫检测仪于530nm波长处测定吸光度值；取稀释乳酸标准品液，同法作标准曲线；按照标准曲线计算样本中的乳酸浓度，并通过细胞蛋白浓度校正，设3复孔做统计分析。

1.3 统计学方法

应用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，组间差异采用 t 检验，率的比较采用χ² 检验，总体生存率分析采用Kaplan ⁃Meier法及Log⁃rank检验。数据结果采用Graph⁃ pad Prism 5软件作图。所有实验重复3次。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT5在结直肠癌组织中的表达情况及与临床参数、疾病预后的相关性

78例结直肠癌标本中，40例（51.28％）SIRT5高表达（图1A），染色颗粒主要分布在胞浆中，而癌旁组织中SIRT5高表达率仅48.72%（38/78）。相较于癌旁组织，癌组织中SIRT5高表达率明显较高（P< 0.05）。对SIRT5在结直肠癌和癌旁组织免疫组化结果进行半定量分析，结果显示SIRT5在结直肠癌组织的表达远远高于癌旁组织（P< 0.01，图1B）。 SIRT5的表达水平与结直肠癌的分化程度、肿瘤大小相关（P< 0.05），而与患者性别、年龄、肿瘤分期、淋巴结转移无关（P> 0.05，表1）。78例结直肠癌患者中，死亡21例，占随访总例数的26.9%；术后复发18例，占随访总例数的23.1%。生存曲线表明相较于SIRT5低表达的结直肠癌患者，SIRT5高表达的结直肠癌患者的总体生存率较低（P< 0.05，图1C）。这些结果表明，SIRT5的高表达往往预示着结直肠癌患者预后不良。

2.2 结直肠癌原发病灶 ¹⁸F ⁃ FDG摄取与SIRT5、 GLUT1表达以及肿瘤分化的关系

当SIRT5表达的染色强度评分分别为0、1、2、3时，结直肠癌的SUVmax值分别为11.04 ± 1.81、 13.31±3.21、15.76±3.76、20.11±3.25；即随着SIRT5表达的增加，SUVmax逐渐增高（Spearman相关系数=0.648，P< 0.05，图2A）。ROC曲线分析提示，当SUVmax=14.78时，¹⁸F⁃FDG PET/CT可以预测SIRT5的表达水平，其诊断灵敏度和特异度分别为51.5%和83.3%（图2B）。2个典型结直肠癌病例所示（图2C），SIRT5高表达者结直肠癌的SUVmax高；SIRT5低表达者结直肠癌的SUVmax低。结直肠癌的分化程度越低，SUVmax值越高（18.18±4.06 vs.12.72± 2.60，P< 0.01，图2D）；同时发现，SIRT5的表达水平也随着分化程度的减低而增高（2.14±0.74 vs.1.10± 0.77，P< 0.01，图2E）。GLUT1是影响肿瘤¹⁸F⁃FDG摄取最关键的因素，结直肠癌GLUT1高表达组的SUVmax值显著大于结直肠癌GLUT1低表达组的SUVmax值（P< 0.05，图2F）。而Spearman相关分析显示，SIRT5表达与GLUT1表达之间存在显著正相关（Spearman相关系数=0.527，P< 0.05）。

2.3 SIRT5对结直肠癌细胞糖酵解的影响及机制

通过CRISPR/Cas 9基因编辑技术在DLD1和HT29细胞内准确敲除SIRT5基因。结果发现，与野生型（wild type，WT）组相比，SIRT5敲除抑制了肿瘤细胞¹⁸F⁃FDG摄取和乳酸的产生（图3A、B）。还发现KO⁃SIRT5显著抑制结直肠癌细胞GLUT1蛋白免疫荧光表达水平（图3C）。荧光素酶报告基因试验证实，SIRT5⁃KO显著抑制了HIF1α的转录活性（图3D）。对细胞进行缺氧处理，SIRT5⁃KO能够部分拮抗缺氧诱导HIF1α活性增高而导致的¹⁸F⁃FDG摄取的增强（图3E）。

3 讨论

Warburg效应是指肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下，仍优先利用糖酵解的方式进行葡萄糖代谢^[7]。基于Warburg效应的分子显像技术 ¹⁸F⁃FDG PET/CT已广泛应用于结直肠癌肿瘤分期、疗效监测、预后判断等领域^[3]。近年来，关于癌基因、糖酵解酶及其下游通路在结直肠癌中的作用是临床、基础科学研究的热点和难点，寻找结直肠癌糖酵解靶向治疗的关键点，并建立分子影像学动态评估、监测体系，对改善结直肠癌的诊治具有重要意义。

最新研究表明，SIRT5不仅是一种蛋白质翻译后修饰调节酶，同时也能发挥致癌作用，可能作为肿瘤治疗的靶点^[6，8]。癌症基因组图谱研究工作组研究结果显示，30%的高级别浆液性卵巢癌SIRT5表达上调^[9]。Yang等^[10] 研究结果显示，敲除SIRT5可以上调丝氨酸羟甲基转移酶的琥珀酰化水平，显著抑制骨肉瘤细胞的生长。本研究结果表明，人结直肠癌组织中SIRT5蛋白表达水平明显高于癌旁组织。SIRT5表达和结直肠癌分化程度以及原发病灶大小相关。SIRT5表达水平较高的患者总体生存率和无病生存率低，预后不良。这些数据表明，SIRT5可能在结直肠癌发生发展过程中发挥重要作用，并可能作为结直肠癌的一种新的诊断标志物或治疗靶点。

进一步研究结直肠癌患者SIRT5的表达、肿瘤临床参数和¹⁸F⁃FDG摄取之间的关系。发现在结直肠癌样本中，低分化的结直肠癌SUVmax明显高于中、高度分化的结直肠癌；这与之前王晓燕等^[11] 的研究结果相一致。同时，研究还发现，低分化肿瘤中SIRT5的表达水平明显高于中、高分化。SUVmax与SIRT5的表达呈显著正相关。体外培养两株结直肠癌细胞，以进一步验证上述临床分析结果。发现KO⁃SIRT5明显抑制了结直肠癌细胞¹⁸F⁃FDG摄取水平。结直肠癌 ¹⁸F ⁃ FDG摄取的增加可能是由于SIRT5的表达增高所致。

在大多数肿瘤细胞中，葡萄糖通过GLUT1转运到细胞中^[12]。结直肠癌¹⁸F⁃FDG摄取也与其细胞膜上GLUT1的表达有关^[13]，但究竟何种致癌因素导致GLUT1表达增高，尚不完全清楚。本研究也再次验证了GLUT1表达和结直肠癌SUVmax之间的正相关性；同时也发现SIRT5表达和GLUT1表达亦呈正相关。Lv等^[14] 发现在非小细胞肺癌H1299细胞中敲减SIRT5会导致GLUT1mRNA和蛋白水平降低。本研究发现，结直肠癌细胞中敲除SIRT5也导致GLUT1蛋白免荧光强度的减低，同时伴随着肿瘤细胞¹⁸F⁃FDG摄取下降。这提示SIRT5可能是通过改变肿瘤细胞GLUT1表达进而影响其 ¹⁸F⁃FDG摄取。Nishida等^[15] 发现，小鼠肝脏中SIRT5可以去丙二酰化糖酵解中的磷酸甘油醛脱氢酶（glyceral⁃ dehydes ⁃ phosphate dehydrogenase，GAPDH），导致GAPDH活性增加，糖酵解通量升高；而Marcon等^[16] 进一步证实SIRT5与GAPDH可以发生蛋白相互作用。缺氧或癌基因引起HIF1α的激活普遍存在于人类肿瘤细胞中，并由此导致肿瘤细胞向糖酵解表型的转换^[17]。HIF1α转录激活涉及肿瘤糖酵解过程的一些关键酶，其中与葡萄糖摄取相关的就是GLUT1。本研究结果表明，KO⁃SIRT5抑制HIF1α转录活性，从而导致GLUT1表达和¹⁸F⁃FDG摄取减少，使用二氯化钴造成人工缺氧环境，诱导HIF1α表达增高，后者可以拮抗SIRT5敲除所导致的HIF1α减低，使肿瘤细胞摄取 ¹⁸F⁃FDG功能恢复。贺帅等^[18] 发现，高糖环境下，SIRT5可能通过己糖激酶或mTOR/HIF1α及其下游的丙酮酸激酶2通路调控糖酵解，促进结肠癌Lovo细胞体外增殖，其机制与本研究有所不同，考虑是由于采用的肿瘤细胞株不同以及肿瘤微环境（高糖）干预条件不同所致。

本研究尚有一些局限性：首先，本研究样本来源于两个医学中心，但总体例数仍较少；其次，本研究为回顾性研究，不可避免选择性偏倚，今后，将进一步开展前瞻性医学研究；最后，本研究中SIRT5促进HIF1α转录活性的具体机制有待进一步深入研究证实。

总之，本研究发现在结直肠癌患者中，¹⁸F⁃FDG摄取与SIRT5表达呈正相关，肿瘤分化程度与SIRT5的表达呈负相关。SIRT5可以通过HIF1α/GLUT1促进 ¹⁸F⁃FDG摄取。SIRT5可能是靶向结直肠癌糖酵解代谢的重要靶点，具有潜在的靶向治疗应用价值。而¹⁸F⁃FDG PET/CT可以无创、实时、动态评估肿瘤细胞糖酵解功能，预测结直肠癌患者SIRT5蛋白的表达，也为结直肠癌精准诊疗提供影像学手段。

参考文献