多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon， PAH）是含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，主要来源于化石燃料、木材等有机物的不完全燃烧，广泛存在于大气、水、土壤等环境中^[1]。可通过呼吸、饮食、皮肤接触等多种途径进入人体，也可经胎盘传给婴儿^[2]，具有高生物蓄积性、半挥发性和持久性的特点。随着经济的快速发展，特别是城市人口和机动车的迅猛增长，家庭燃煤取暖和汽车尾气排放等因素使得PAH成为我国城市空气中不容忽视的重点污染物之一^[3-5]。长期慢性暴露PAH会诱发DNA加合物的形成^[6]、染色体畸变，可引起成人和儿童肺功能下降，增加慢性阻塞性肺病的发病率和死亡率^[7-9]。不同于SO₂、NO₂、CO、O₃、PM_2.5和PM₁₀等空气污染物的强制性监测，大气中PAH的含量目前在我国暂无权威官方数据发布。最近有报道称，PAH污染可改变与健康结局相关的共生和环境细菌的种类和丰度，导致微生物种群的失衡，进而危及人体健康^[10]。因此，本研究通过分析大气PAH含量与空气微生物种群的相关关系，为评估大气PAH健康风险提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

利用KC⁃120H型智能中流量TSP采样器（青岛崂山电子仪器总厂有限公司），玻璃纤维滤膜采集大气中的颗粒态PAH。利用国产JWL⁃6撞击式空气生物粒子采样器（常州康华仪器）进行空气微生物取样测定。

1.2 方法

1.2.1 采样点设置

本研究的观测采样点位于南京市江宁区南京医科大学至诚楼外，采样高度为1m。该区域远离工厂排放源，距离采样点500m有双向6车道马路。

1.2.2 采样时间

大气PAH采样时间段为2019年4月16日—6月11日、9月20日—11月15日；2020年5月4日—6月7日、9月27日—11月18日每次采样时间为2h。同时进行空气微生物采集，采集时间为20min。

1.2.3 大气颗粒型PAH样品采集

采样方法依据《环境空气质量手工监测技术规范》HJ 194⁃2017。为保证实验精度，滤膜经干燥箱充分干燥处理。采样流量设为100L/min。采样结束后，玻璃纤维滤膜用锡纸包裹置于干燥箱避光至少24h，放入-20℃冰箱保存待测。每次采样均设置空白。

1.2.4 大气微生物样品采集

采样依据《公共场所卫生检验方法》GB/T18204.3⁃2013第3部分：空气微生物。采样皿为普通营养琼脂培养基（蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g/L）。采样流量设为28L/min。采样结束后，平皿于37℃培养48h，之后用生理盐水冲洗，收集冲洗液，8 000r/min室温离心5min，去上清，沉淀于-80℃保存待测。

1.2.5 样品检测

大气PAH浓度测定：使用镊子和不锈钢剪刀将滤膜对半剪开，待测样品置于干净的锥形瓶中，加入50mL二氯甲烷、40 μL 1 μg/mL的内标（菲Phe⁃ d10，屈Chr⁃d12，Supelco公司，美国），密封超声萃取40min（80%超声强度），10mL上清液移入试管， 40℃氮气浓缩近干，用200 μL二氯甲烷定容。实验前，所有玻璃仪器须用色谱纯甲醇浸泡，后用色谱纯二氯甲烷润洗。标准曲线的配制：用二氯甲烷稀释20 μg/mL标准品到100、50、10、5、1ng/mL（分别加50 μL 1 μg/mL的内标），上机测定以同位素为内标进行校准。GC⁃MS气相色谱⁃质谱联用仪（TRACE 1310，赛默飞世尔科技公司，美国），色谱柱（DB⁃5MS， 30m，液膜厚0.25 μm，内径0.25mm）。升温程序：初始柱温80℃，保持2min，8℃/min升至300℃，保持此温度10min。载气：高纯氦气；流速：1.0mL/min；进样量：2 μL；进样口温度：260℃；进样方式：不分流进样。离子源：EI；离子源温度：280℃传输线温度280℃；扫描方式：SRM扫描。对EPA 16种优控PAH的混合标准溶液（20 μg/mL，Supelco公司，美国）进行浓度测定：萘Nap、苊烯Any、苊Ana、芴Flu、菲Phe、蒽Ant、荧蒽Fla、芘Pyr、苯并[a]蒽BaA、屈Chr、苯并[b]荧蒽BbF、苯并[k]荧蒽BkF、苯并[a]芘BaP、茚并[1，2，3⁃cd]芘InP、二苯并[a，h]蒽DBA、苯并[g，h，i]苝BgP。Phe⁃d10和Chr ⁃d12回收率分别为66.8%和123.7%。每次采样时均采用野外空白，将空白滤膜放置于采样器旁，与其他样品处理方法相同，最后扣除空白浓度。13种PAH的仪器检出限在0.02~0.20ng/mL（其中萘、苊烯和苊回收率不佳，未纳入计算）。

空气微生物多样性分析：根据E.Z.N.A.^® soil试剂盒（Omega Bio⁃tek公司，美国）说明书进行总DNA抽提。采用引物（338F：5′ ⁃ ACTCCTACGGGAG⁃ GCAGCAG ⁃ 3′；806R：5′⁃ GGACTACHVGGGTWTC⁃ TAAT⁃3′）对细菌16S rRNA基因的V3⁃V4可变区进行PCR扩增（ABI GeneAmp^® 9700型）。扩增体系为20 μL：4 μL 5× Fast Pfu缓冲液，2 μL 2.5mmol/L dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL Fast Pfu聚合酶，10ng DNA模板。PCR条件如下：95℃变性3min， 27次循环（95°C 30s变性，55℃ 30s退火，72℃ 45s延伸），最后72℃ 10min。PCR产物经回收后纯化。利用Miseq PE300（Illumina公司，美国）平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接。使用UPARSE软件（version 7.1， http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库 （SSU123），设置比对阈值为70%。数据分析在上海美吉生物医药科技有限公司旗下的免费在线I⁃Sanger云平台（www.i⁃sanger.com）上进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对大气PAH浓度与空气微生物种群进行Pearson相关性分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大气PAH浓度分析

分析了2019—2020年南京某地区大气中13种PAH的浓度，13种PAH根据芳烃环数不同分为3环 （芴Flu、菲Phe、蒽Ant），4环（荧蒽Fla、芘Pyr、苯并 [a]蒽BaA、屈Chr），5环（苯并[b]荧蒽BbF、苯并[k] 荧蒽BkF、苯并[a]芘BaP），6环（二苯并[a，h]蒽DBA、茚并[1，2，3⁃cd]芘InP、苯并[g，h，i]苝BgP）。采用的收集方法，主要是针对颗粒态PAH，其中萘、苊烯和苊回收率不佳，未纳入计算。大气PAH中菲Phe、荧蒽Fla和芘Pyr占主要成分。2019年秋季大气PAH浓度明显高于春季。2020年春秋两季大气PAH浓度无明显差异（图1A、1B，表1）。

2.2 空气中微生物群落组成

2019年与2020年微生物多样性分析可知，在微生物门水平上，2019年和2020年优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）（图2A、B）。

2019、2020年微生物属水平分析可知，2019年优势菌属为芽胞杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphy⁃ lococcus）和微球菌属（Micrococcus）。2020年则为芽胞杆菌属（Bacillus）和虚构芽胞杆菌属（Fictibacil⁃ lus）。其中，芽胞杆菌属为2019和2020年共同优势菌属（图3A、3B）。

2.3 大气PAH与微生物群落相关性分析

将2019年和2020年的大气PAH浓度分别与微生物属水平进行Pearson相关分析可知，2019年在属水平上，芽胞杆菌属（Bacillus）与Fla和总PAH呈正相关；微球菌属（Micrococcus）与BbF、BaP、DBA/InP和BgP水平呈正相关（P< 0.05）；土壤芽胞杆菌属 （Solibacillus）与Chr和BkF水平呈正相关（P< 0.05）。 2020年属水平上，假芽胞杆菌属（Fictibacillus）与BkF水平呈正相关（P< 0.05）；不动杆菌属（Acinetobacter）与Flu的水平呈正相关；鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas） 与Pyr、BaA和DBA/InP的水平呈正相关（P< 0.05）；考克氏菌属（Kocuria）的丰度与Chr、BbF、BkF和Pyr呈正相关（P< 0.05）；节杆菌属（Arthrobacter）的丰度与BaA、Chr和Ant的水平呈正相关。

对2019—2020年属水平大气微生物与PAH综合进行相关性分析，类芽胞杆菌属（Paenibacillus）丰度与BkF呈正相关（P< 0.05）；短杆菌属（Curtobacte⁃ rium）丰度与BaA、Chr和BaP呈正相关（P< 0.05）； 赖氨酸芽胞杆菌属与Fla、Chr、BbF、BaP、INP/DBA和BgP均呈正相关（P< 0.01）；考克氏菌属（Kocuria） 丰度与BbF呈正相关（P< 0.05）；不动杆菌属（Aci⁃ netobacter）与BkF呈正相关；微球菌属（Micrococcus）与土壤芽胞杆菌属（Terribacillus）均与BbF、INP/DBA和BgP呈正相关（P< 0.01）。

3 讨论

大气PAH中2~3环PAH为气态，多存在于气相中，而4环PAH为过渡态，在颗粒物和气相中均存在，5~7环的PAH多存在固相颗粒物中。本研究主要对大气中颗粒态PAH进行检测分析。据报道， 2001—2002年南京大气中PAH的平均水平是62.6ng/m^3[11]，2014年为18.9ng/m^3[12]。2013年8月我国环保部发布实施6项空气质量检测标准，国家加快推进大气污染防治。本研究中南京大气2019—2020年春秋两季检测的13种PAH总浓度高达21.74ng/m³。南京大气PAH均以3、4碳环菲、荧蒽及芘为主。2019年大气PAH平均浓度约7.63ng/m³，而2020年约3.04ng/m³。这很可能是受疫情时期停工停产的影响，也有可能与本市的亚热带季风气候有关，其中各季风的来源、太阳辐射强度、降水量等都是影响大气PAH浓度的重要因素^[13]。本市颗粒物中的PAH来源与北方燃煤污染城市区别较大，而机动车尾气排放导致的PAH的增加不容忽视^[14]。本研究中，在组分上2019年大气颗粒态PAH主要是菲Phe、荧蒽Fla、芘Pyr、苯并[g，h，i]苝BgP、屈Chr和苯并[b]荧蒽BbF。2020年苯并[g，h，i]苝BgP、屈Chr和苯并[b]荧蒽BbF水平明显降低，而菲Phe、荧蒽Fla、芘Pyr和苯并[a]蒽BaA的水平显著升高。为了更好地响应十九届四中全会精神，南京市该区对产业结构进行较大调整，对高污染企业（化工、燃煤、铸造、瓦砖等）进行较大力度的整治，持续化解经济高速发展与生态环境之间的矛盾，并在空气质量改善方面取得了一定成绩^[15]。

本研究在PAH与微生物种群相关分析中发现，厚壁菌门中的芽胞杆菌属和放线菌门中的微球菌属丰度与大气PAH相关。据报道，PAH能够通过干扰共生微生物的内分泌信号通路，对环境和共生菌群产生一定影响^[16]。微球菌属是最常见的PAH降解细菌分离物之一^[17-18]。而芽胞杆菌属与大气中多种PAH浓度呈正相关，芽胞菌属具有降解环境中的萘、菲、屈、芘、苯并[a]芘和苯并[a]蒽的作用^[19]。研究者从污泥（长期被焦化废水污染）中分离得到1株芽胞杆菌，在单基质及混合基质条件下，蒽、菲、芘均得到了良好的降解^[20]。除此之外，相关研究表明大气中的PAH水平与环境和机体共生菌群之间存在相关性。1项在芬兰进行的研究也报道了大气PAH浓度与托儿所空气中的放线菌门及儿童皮肤菌属之间的联系，并进一步分析发现，其中的差异微生物对内分泌代谢具有干扰作用^[21]。Sow⁃ ada等^[22] 在上呼吸道咳嗽综合征、慢性阻塞性肺病、哮喘等患者肺部中发现的优势菌群包括厚壁菌门和放线菌门，提示PAH污染可通过影响微生物多样性与呼吸道免疫性疾病相关。因此，关注PAH污染引起的健康相关菌群的变化及健康风险，能够为PAH的健康风险评价提供基础资料，对实施合理的环境干预手段和健康风险评价具有重要指导意义。

参考文献