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通讯作者:

王永庆,E-mail:wyqjsph@163.com;

陈安九,wulynj@163.com

中图分类号:R965

文献标识码:A

文章编号:1007-4368(2022)06-802-07

DOI:10.7655/NYDXBNS20220606

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目录contents

    摘要

    目的:探索兰索拉唑(lansoprazole,LPZ)对大鼠心肌细胞H9C2的潜在损伤效应及相关机制。方法:以10 μmol/L LPZ 孵育 H9C2 细胞不同时间(0 h、12 h、24 h、48 h)后,采用 DCFH⁃DA 荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平,Western blot检测内质网应激蛋白(GRP78、CHOP)及凋亡相关蛋白(Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C、 Bax/Bcl⁃2)的表达。此外,兰索拉唑及ROS抑制剂N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸(N⁃acetyl⁃L⁃cysteine,NAC)单独或联合孵育细胞48 h后, 检测H9C2细胞内ROS水平,以及内质网应激和凋亡相关蛋白的表达情况。结果:LPZ可以时间依赖性增加ROS的水平,诱导 GRP78和CHOP的表达,并进一步增加Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C、Bax/Bcl⁃2的表达。NAC显著降低LPZ诱导的ROS水平,降低GRP78、CHOP以及Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C、Bax/Bcl⁃2的表达水平。结论:LPZ可诱导心肌细胞凋亡,机制可能与氧化应激和内质网应激有关。

    Abstract

    Objective:This study aims to explore the potential damage effect and related mechanisms of lansoprazole(LPZ)on rat cardiomyocytes(H9C2). Methods:After incubating H9C2 cells with 10 μmol/L LPZ for 0 h,12 h,24 hand 48 h,DCFH ⁃ DA fluorescent probe was used to detect the level of reactive oxygen species(ROS). And the expression of endoplasmic reticulum stressproteins(GRP78,CHOP)and apoptosis ⁃ related proteins(Cleaved ⁃ Caspase ⁃ 12,Cleaved ⁃ Caspase ⁃ 3,Cyt C,Bax/Bcl ⁃ 2)was detected by Western blot. In addition,the level of ROS,as well as the expression of endoplasmic reticulum stress and apoptosis⁃related proteins were evaluated after H9C2 cells incubating with LPZ alone or in combination with ROS inhibitor N⁃Acetyl⁃L⁃cysteine(NAC) for 48 h. Results:Lansoprazole could time ⁃dependently increase the level of ROS,induce the expression of GRP78 and CHOP,and further increase the expression of Cleaved ⁃Caspase ⁃12,Cleaved ⁃Caspase ⁃3,Cyt C,and Bax/Bcl ⁃2. NAC significantly reduced LPZ ⁃ induced ROS levels,and decreased the expression levels of GRP78,CHOP,Cleaved⁃Caspase⁃12,Cleaved⁃Caspase⁃3,Cyt C and Bax/ Bcl⁃2. Conclusion:LPZ could induce cardiomyocyte apoptosis,and the mechanism may be related to oxidative stress and endoplasmic reticulum stress.

  • 兰索拉唑(lansoprazole,LPZ)是二代质子泵抑制剂(proton pump inhibitor,PPI),主要通过抑制胃壁细胞的H+/K+ ⁃ATP酶系统来阻断胃酸分泌,以达到抑酸的效果[1]。临床广泛用于胃溃疡、十二指肠溃疡、反流性食管炎以及卓⁃艾综合征的治疗,也可与其他药物联合用于治疗幽门螺旋杆菌感染。随着LPZ在临床的广泛应用,特别是长期使用,其潜在的不良反应逐渐引起研究者的关注。短期使用LPZ常见的不良反应主要包括腹痛、便秘、腹泻、恶心、头晕或头痛等。长期或大剂量使用LPZ可能会导致骨质疏松、感染、肾脏损伤、维生素B12等微量元素缺乏,并增加心血管事件的发生风险[2-3]。研究表明,长期大剂量使用PPI可导致心动过快[4],也有调查报告显示,163例PPI所致严重不良反应中,心血管系统不良反应有7例,占4.29%[5]。心血管事件主要包括心肌梗死、心力衰竭等,而心肌梗死的发生与细胞内钙超载、活性氧增加、心肌细胞凋亡和线粒体破坏等特定途径有关[6-7]

  • 活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一种引起氧化应激的过氧化物,可通过损伤细胞膜脂质及脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid,DNA) 等机制损伤细胞[8]。ROS已被证实可以引发内质网应激,从而参与细胞凋亡过程[9]。内质网应激是一种新的凋亡途径,参与各种状态下的细胞凋亡。当内质网处于应激状态时,内质网的分子伴侣如葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)会相应增加,GRP78是内质网应激反应的标志蛋白,与错误折叠的蛋白或未折叠的蛋白相结合,使细胞进入降解途径[10]。内质网应激诱导的下游凋亡信号通路包括CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白或生长停滞及DNA损伤诱导基因153(CHOP/GADD153)、c ⁃ Jun氨基末端激酶 (JNK)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cyste⁃ inyl aspartate⁃specific proteinase,Caspase)通路。内环境处于稳态时,C/EBP同源蛋白(C/EBP⁃homolo⁃ gous protein,CHOP)和Caspase⁃12的表达很弱,当稳态失衡时,细胞发生内质网应激,CHOP和Cas⁃ pase ⁃12的表达明显升高,过度表达的CHOP和Caspase⁃12会促使细胞周期停滞甚至导致细胞凋亡[10]。凋亡被认为是心肌损伤的重要潜在机制之一。因此,本研究以心肌细胞中ROS为基础,运用Western blot、荧光显微等技术,探究LPZ增加心血管风险的可能机制,为临床安全用药提供一定参考。

  • 1 材料和方法

  • 1.1 材料

  • 1.1.1 细胞株

  • H9C2(大鼠心肌细胞),购于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。

  • 1.1.2 药品与试剂

  • 兰索拉唑标准品(纯度99.6%,中国食品药品检定研究院);DMEM培养基、胎牛血清、Trypsin⁃EDTA消化液(Biological Industries公司,以色列);二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)(Sigma公司,美国);GAPDH抗体、GRP78抗体、细胞色素C(cyto⁃ chrome C,Cyt C)抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(武汉塞维尔生物科技有限公司);B细胞淋巴瘤/白血病2 (B⁃cell lymphoma/leukemia2,Bcl⁃2)抗体(Abcam公司,英国);Cleaved ⁃Caspase ⁃12抗体、CHOP抗体、 Cleaved⁃Caspase⁃3抗体(CST公司,美国);Bcl⁃2相关X蛋白(Bcl⁃2⁃associated X protein,Bax)抗体(Protein⁃ tech公司,美国);β⁃actin抗体(Affinity公司,美国); N ⁃乙酰⁃L ⁃半胱氨酸(N ⁃acetyl ⁃L ⁃cysteine,NAC)、 PMSF、RIPA裂解液(杭州碧云天生物技术有限公司)。

  • 1.1.3 主要仪器

  • CO2培养箱HF100(上海力申科学仪器有限公司),离心机(Eppendorf公司,美国),倒置荧光显微镜IX73(Olympus公司,日本),电泳仪PowerPacTM BASIC(Bio⁃Rad公司,美国),超声破碎仪(Sonics公司,美国),化学发光图像分析系统(Tanon 5200Multi,上海天能科技有限公司),流式细胞分析仪 (Beckman Coulter公司,美国)。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 细胞培养及分组

  • H9C2贴壁生长,正常培养阶段使用含1%双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,隔天换液。细胞给药阶段用含有0.1%DMSO、1%双抗和10%胎牛血清的培养基或相应的含药培养基进行培养,每天换液。细胞于37℃、含有5%CO2的培养箱中培养,当细胞密度长至80%左右时进行传代,传代比例为1∶3,取状态良好的对数生长期细胞进行实验。

  • 第一阶段实验分为0h组、12h组、24h组和48h组,各组细胞间DMSO含量、培养时间保持一致, LPZ浓度为10 μmol/L。第二阶段实验分为Con组、 LPZ组、NAC组、LPZ+NAC组共4组。Con组为对照组;LPZ组中含有10 μmol/L LPZ;NAC组中含有1mmol/L NAC;LPZ+NAC组中含有1mmol/L NAC和10 μmol/L LPZ,各组间DMSO含量保持一致,共同培养48h。

  • 1.2.2 ROS荧光检测

  • 对数生长期细胞以3×104 个/mL接种至6孔细胞培养板,每孔2mL,置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养24h,细胞给药后培养一定时间,用10 μmol/L DCFH⁃DA染液于37℃培养箱孵育20min,用无血清培养基清洗3次,以488nm为激发波长在荧光显微镜下进行观察。

  • 1.2.3 Western blot法检测蛋白表达

  • 对数生长期细胞以3×104 个/mL个接种至6孔细胞培养板,每孔2mL,置于37℃、含有5%CO2的培养箱中培养24h,细胞给药后培养一定时间,用RIPA裂解液(使用前2min内加入蛋白酶抑制剂)冰上裂解细胞15min,刮取的细胞裂解液用细胞破碎仪冰上超声3~5次,每次5s,然后离心取上清。根据BCA试剂盒操作说明测定蛋白浓度,调齐浓度后加入5× 蛋白上样缓冲液煮沸10min,变性后的蛋白样本立即使用或保存于-80℃冰箱。使用10%或12%的SDS⁃PAGE分离胶,按照每孔35 μg的上样量进行电泳,待蛋白分离后停止电泳。用湿转法转移至PVDF膜上,室温条件下用5%脱脂牛奶封闭90min,经TBST漂洗后放入相应的一抗中,4℃孵育过夜。次日取出条带,用TBST缓冲液漂洗3次,每次10min。室温条件下在摇床上孵育二抗约1h,结束后仍用TBST缓冲液漂洗3次,最后使用Tanon显色系统进行显影。用Image J软件对Western blot条带进行半定量分析,各给药组目的蛋白的表达用对照组进行标准化。

  • 1.3 统计学方法

  • 实验数据以均数±标准差(x-±s)的形式表示,所有数据均使用Graph Pad Prism 9软件进行统计分析,多组间比较使用单因素方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。每项实验均独立重复3次,使用Graph Pad Prism 9软件进行作图。

  • 2 结果

  • 2.1 LPZ时间依赖性地诱导氧化应激

  • 为了研究LPZ长期作用对H9C2中ROS水平的影响,分别用10 μmol/L LPZ孵育细胞12、24、48h后,采用ROS检测试剂盒进行检测。结果如图1所示,10 μmol/L LPZ孵育细胞48h,ROS荧光强度与对照组相比差异有统计学意义,LPZ可以时间依赖性地诱导氧化应激。

  • 2.2 LPZ时间依赖性地诱导内质网应激,增加凋亡相关蛋白的表达

  • 为了研究LPZ对H9C2细胞内质网应激和凋亡相关蛋白表达的影响,分别用LPZ孵育细胞12、24、 48h后,用Western blot进行检测。结果显示,LPZ可以时间依赖性地增加H9C2中内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达,且在48h时最为明显(图2)。Caspase⁃12和Caspase⁃3的激活在内质网应激诱导的细胞凋亡中起关键作用。LPZ时间依赖性地增加Cleaved⁃Caspase⁃12和Cleaved⁃Caspase⁃3蛋白的表达,且在给药24h时蛋白表达与0h比较,差异有统计学意义(图3),说明LPZ引发H9C2细胞内质网应激后触发凋亡。Bax凋亡蛋白表达呈时间依赖性增加,Bcl⁃2抗凋亡蛋白表达呈时间依赖性降低, Cyt C蛋白表达呈时间依赖性增加,进一步说明LPZ时间依赖性地诱导细胞凋亡。

  • 图1 LPZ对H9C2细胞氧化应激的影响

  • Fig.1 The effects of LPZ on oxidative stress in H9C2cells

  • 2.3 ROS抑制剂能缓解LPZ诱导的心肌损伤

  • 为了进一步验证氧化应激在LPZ诱导的内质网应激和细胞凋亡中的作用,本研究使用ROS抑制剂NAC(1mmol/L)单独或联合LPZ共同孵育细胞48h,并用ROS检测试剂盒和Western blot检测ROS和蛋白表达水平的变化。与Con组相比,LPZ组ROS荧光强度增强,而NAC组和NAC+LPZ组荧光强度无显著变化(图4),说明NAC对LPZ诱导的ROS荧光增强有显著抑制作用。与Con组相比,LPZ组内质网应激蛋白GRP78和CHOP表达增强,而NAC组和NAC+LPZ组内质网应激蛋白表达无显著变化(图5),说明NAC对LPZ诱导的内质网应激有显著抑制作用。与Con组相比,LPZ组内质网应激诱导的凋亡相关蛋白Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase⁃3、 Cyt C和Bax/Bcl⁃2表达增强,而NAC组和NAC+LPZ组蛋白表达无显著变化(图6),说明NAC对LPZ诱导的凋亡有显著抑制作用。

  • 3 讨论

  • LPZ是苯并咪唑类化合物,口服后在酸性条件下转化为活性代谢物发挥药理活性,抑制胃酸分泌的最后一步。由于临床使用量逐年增加,潜在的不良反应逐渐引起研究者的关注。LPZ在心脏方面的潜在作用存在争议。Patil等[11] 在大鼠体内的研究表明,多次服用LPZ和奥美拉唑可以通过降低氧化应激和促炎性细胞因子,降低异丙肾上腺素诱发的心肌梗死。然而,Sehested等[12] 的观察性研究结果表明,大剂量PPI长期使用会诱发缺血性卒中和心肌梗死,6个月内发生缺血性卒中的风险增加29%,发生心肌梗死的风险增加36%。在一项随机双盲多中心研究中,LPZ组230例患者中有4例发生严重不良反应,其中包括心律失常[13]。本研究表明,长期使用LPZ会诱导心肌细胞氧化应激和内质网应激,导致细胞凋亡。LPZ需要在胃液中活化后发挥抑酸作用,但是心肌细胞内的pH不足以使LPZ发生质子化,因此本研究采用LPZ原型药物进行实验,符合药物在心脏组织中的实际情况。

  • 图2 LPZ对H9C2细胞内质网应激蛋白表达的影响

  • Fig.2 The effects of LPZ on expression of endoplasmic reticulum stress protein in H9C2cells

  • 图3 LPZ对H9C2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

  • Fig.3 The effects of LPZ on expression of apoptosis related proteins in H9C2cells

  • 图4 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞氧化应激的影响

  • Fig.4 The effects of NAC on LPZ⁃induced oxidative stress in H9C2cells

  • 图5 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞内质网应激蛋白表达的影响

  • Fig.5 The effects of NAC on expression of LPZ⁃induced endoplasmic reticulum stress proteins in H9C2cells

  • 心肌缺血或梗死时,心肌细胞和内皮细胞ROS产生会大量增加[14]。ROS是引起内质网应激的上游信号分子,氧化应激通常会导致内质网应激,参与并调节细胞凋亡过程[15]。内质网是一个广泛的细胞内膜网络,其相关功能在心脏生理和病理中至关重要[16]。某些因素如氧化应激、缺血和钙稳态等会引起内质网应激,内质网的分子伴侣如GRP78和钙网蛋白的产生都会相应增加,也会启动凋亡信号,包括切割的Caspase⁃3和Caspase⁃12,最终会导致细胞凋亡[17-18]。内质网应激启动的细胞凋亡与各种疾病的病理生理学有关,包括心血管疾病,如心肌肥厚、心力衰竭、动脉粥样硬化和缺血性心脏病[19]。此外,在内质网和线粒体上表达的Bcl⁃2家族也参与调控内质网应激引起的细胞死亡。Bcl⁃2是抗凋亡因子,Bax是促凋亡因子,Bcl⁃2亚家族蛋白包括Bcl⁃2和Bcl⁃XL,通过抑制Bax亚家族蛋白,阻止线粒体释放Caspase激活因子,从而抑制细胞凋亡。CHOP诱导细胞凋亡的一个重要途径是调节Bcl⁃2家族促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡[19]。本研究用LPZ孵育H9C2不同时间后发现,LPZ能时间依赖性增加ROS荧光,并显著增加GRP78和CHOP的表达,说明长期使用LPZ能诱导氧化应激,进一步诱导内质网应激。此外,LPZ增加了H9C2细胞Cleaved⁃Caspase⁃ 12、Cleaved⁃Caspase⁃3、Cyt C及Bax/Bcl⁃2的表达,提示LPZ能诱导心肌细胞凋亡。

  • 图6 NAC对LPZ诱导的H9C2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

  • Fig.6 The effects of NAC on expression of LPZ⁃induced apoptosis related proteins in H9C2cells

  • NAC是一种含有巯基的抗氧化剂,可促进还原谷胱甘肽的合成,加快细胞内自由基的清除[20]。为了进一步验证LPZ诱导的心肌细胞凋亡与氧化应激的相关性,本研究将ROS抑制剂NAC单独或联合LPZ共同作用于细胞48h。结果显示,1mmol/L NAC单独作用于H9C2细胞48h对ROS荧光和内质网应激相关蛋白的表达没有影响,也不会增加凋亡相关蛋白的表达,但是能显著减弱由LPZ诱导的ROS荧光增加,并很大程度上抑制由LPZ诱导的GRP78、CHOP、Cleaved⁃Caspase⁃12、Cleaved⁃Caspase ⁃3、Cyt C及Bax/Bcl⁃2表达增加,这些结果进一步验证了LPZ诱导的心肌细胞损伤与氧化应激有较大相关性。降低心肌细胞ROS水平,阻断调亡信号通路可有效抑制LPZ诱导的细胞调亡,对LPZ长期使用导致的心脏不良反应的治疗和预防具有指导意义。

  • 综上所述,临床相关浓度的LPZ可能通过氧化应激诱导心肌细胞损伤。本研究表明ROS可作为预防LPZ相关心脏不良反应的潜在靶点,可以进行深入研究。NAC通过抗氧化作用减少心肌细胞调亡,从而保护心脏,这对LPZ临床合理使用有重要作用。

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