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自噬在造血干细胞中的缺失会导致多系血细胞的异常分化[1-2]。许多血液病尤其是血小板相关疾病伴随着自噬水平的上调，例如特发性血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenia，ITP）和伴随血小板减少的骨髓异常增生综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）[2-3]。因此，近年来自噬对巨核细胞增殖分化和血小板生成的影响受到广泛关注[4]。
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自噬是一个特殊的细胞代谢过程，能帮助细胞适应多种应激状态。细胞的自噬主要分为3种形式：微自噬、巨自噬（简称自噬）和分子伴侣介导的自噬。巨自噬是通常意义上的自噬，它通过一个双层膜的细胞器——自噬小体，将细胞内细胞器和胞浆内的组分重新利用[5-6]。自噬小体来源于膜状的类似帽子结构的前体结构，在该结构的两极开始生长，最终形成一个完整的封闭的充满胞浆和细胞器的细胞器。研究报道，自噬对巨核细胞和血小板的发育起重要作用[7⁃8]。例如在造血系统中特异性敲除自噬相关基因Atg7的自噬缺失小鼠（Atg7flox/flox Vav⁃Cre）巨核祖细胞数量大量减少并出现巨大血小板症[9]。进一步研究表明，这些小鼠的巨核细胞发育及血小板生成异常是源于细胞线粒体的功能障碍和细胞周期的阻滞[10]。另外，Mortensen等[9] 研究证实，在巨核细胞和血小板上特异性敲除Atg7基因会导致小鼠Atg7flox/flox PF4⁃Cre自噬缺失并且血小板的功能异常。由此可见，自噬在巨核细胞发育及血小板生成中起到重要作用。
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C型凝集素样受体⁃2（C⁃type lectin like receptor 2， CLEC⁃2）是一个非经典型的C型凝集素受体，主要表达在血小板和巨核细胞表面。研究表明，特异性敲除巨核细胞Syk基因的小鼠Sykflox/floxPF4⁃Cre，其巨核细胞的成熟发育受到影响[11]。另外，Syk信号通路已被证实参与巨核细胞的自噬过程[12]。而研究表明CLEC⁃2可以通过激活Syk信号通路激活Plcγ2，级联放大PKC信号通路，从而活化血小板[13-14]。为进一步认识CLEC⁃2在体内调控巨核细胞自噬的作用，本研究使用CLEC⁃2缺陷小鼠，检测CLEC⁃2在调控自噬中的作用。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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C57BL/6J（B6，CD45.2）小鼠、C57BL/6J背景的CLEC⁃2基因敲除鼠购于苏州西山生物科技公司[动物质量合格证号为SCXK（沪）2017⁃0012]。实验中使用的小鼠均在苏州大学无特定病原体（SPF）饲养间养殖[动物饲养合格证号为SYXK（苏）2017 ⁃ 0043]。性别相同且同窝出生的野生型（WT）小鼠作为正常对照。实验小鼠均采用8~12周龄，所涉及动物实验经由苏州大学动物管理和使用委员会批准。
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雷帕霉素（rapamycin，Rap）（Cell Signaling Tech⁃ nology，cat No.9904，美国），山羊抗兔的IRDye800CW、山羊抗小鼠的IRDye800CW荧光二抗 （LICOR Biosciences公司，美国），FITC标记的大鼠抗小鼠的CD41（Cat No.553848，BD Biosciences公司，美国），PE标记的罗马尼亚仓鼠抗小鼠的CD61 （Cat No.12⁃0611，eBioscience公司，美国），红外成像系统（LI⁃COR Biosciences公司，美国）。
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1.2 方法
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1.2.1 原代巨核细胞的培养
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断颈处死怀孕14.5d的C57BL/6J小鼠，C57BL/6J背景的CLEC⁃2基因敲除小鼠，用提前高温灭菌的直剪剖开孕鼠的腹部取出全部胚胎，放入提前预热的1×PBS或者DMEM培养基至直径为100mm的培养皿内，接着进行胎肝计数，分离胎肝。取完胎肝后进行胎肝单细胞悬液的制备。用1mL的蓝色枪头小心将胎肝连同培养基一起吸入孔径为70 μm的无菌细胞筛，研磨组织，反复研磨之后将培养皿内的细胞悬液用新的无菌筛网过滤并收集至无菌50mL离心管内，制成单细胞悬液，400 g离心5min，弃上清。细胞的培养过程中还需在胎肝细胞获取的第1天添加细胞因子血小板生成素（thrombopoietin， TPO）10ng/mL。
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1.2.2 原代巨核细胞纯化
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胎肝细胞用细胞因子连续诱导分化5d（不换培养基），并在第5天用含1.5%BSA的1×PBS溶液密度梯度沉降法纯化已诱导成熟的巨核细胞。分别在15mL无菌离心管内加上1.5mL 3%BSA和1.5mL 1.5%BSA溶液，再将细胞培养基小心沿着管壁加在分离液的上面。细胞纯化时间为50min~1h，纯化完毕后离心管的下部白色絮状沉淀即为成熟的巨核细胞，不需离心只需将沉淀上方的培养基以及BSA溶液全部吸走即能得到巨核细胞进行后续的实验。
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1.2.3 体外用药物上调细胞自噬
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Rap 200nmol/L处理原代第1天获得的胎肝细胞5d或者BSA纯化之后的巨核细胞6h，对照组用0.2%DMSO处理。
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1.2.4 蛋白检测
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巨核细胞或血小板用1×PBS离心洗涤之后，用新配制的含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1×RIPA裂解液进行冰上裂解30min。细胞的蛋白浓度用BCA试剂盒进行检测。每组样品的蛋白上样量为30 μg，用SDS⁃PAGE胶电泳，纤维素膜转膜。转好的纤维素膜用5%的脱脂牛奶在室温下封闭1h，并和一抗在4℃摇床上孵育过夜，第2天将纤维素膜和山羊抗兔的IRDye800CW或者山羊抗小鼠的IRDye800CW荧光二抗室温下共同孵育1h，红外成像系统观察目的条带。
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1.2.5 流式细胞术检测血小板表面蛋白CD41 和CD61
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上述分离出的胎肝巨核细胞加入500 μL的1× PBS，2 000r/min离心5min，再用100 μL 1×PBS重悬全血，加入FITC标记的大鼠抗小鼠的CD41抗体和PE标记的罗马尼亚仓鼠抗小鼠的CD61抗体各0.5 μL，同时室温避光孵育40min，再用1×PBS离心洗去多余未结合的抗体并重悬细胞即可上机进行检测，并进行双阳性率分析比较。
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1.2.6 小鼠骨髓的免疫荧光染色
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野生型小鼠和CLEC⁃2敲除小鼠腹腔注射1mg/kg Rap，24h后腹腔注射7%水合氯醛（5 μL/g）麻醉小鼠，取出骨髓，立即置于4%多聚甲醛中4℃固定过夜，将固定后的骨髓置于脱钙液中4℃过夜，PBS室温摇洗，固定好的组织置于20%蔗糖中4℃脱水过夜，次日将组织用OCT包埋，迅速放置在平整的干冰上冷冻，保存于-80℃备用。制备好的冰冻组织切块，固定于冰冻切片机上，切成5 μm厚的冰冻切片，加入标记的CD41和LC3抗体，共聚焦显微镜观察并拍照。
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1.3 统计学方法
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使用Prism 6.0软件进行统计分析。所有数据均来自至少3次独立实验。数据以均数±标准误（）表示，使用Graphpad统计分析，当数据为3组或以上时使用one way ANOVA。P< 0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 自噬基因在胎肝来源的巨核细胞中的表达
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成熟的巨核细胞可以通过原代胎肝细胞加入细胞因子体外诱导培养获得。本研究表明自噬重要相关基因ATG7、ATG5、LC3蛋白在胎肝来源的巨核细胞中均有表达（图1）。
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2.2 Rap处理胎肝细胞能抑制巨核细胞CLEC⁃2的表达
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为探讨自噬紊乱是否影响胎肝来源的巨核细胞CLEC⁃2的表达，在分离胎肝细胞的第1天加入Rap与细胞因子TPO共同孵育培养5d，诱导出巨核细胞并通过流式细胞仪进行巨核细胞表面CLEC⁃2表达分析检测。Rap导致胎肝巨核细胞CLEC⁃2表达下调（图2）。
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图1 小鼠胎肝和骨髓来源的巨核细胞和血小板中的自噬基因表达
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Fig.1 Autophagy gene expression in mice fetal liver and bone marrow⁃derived megakaryocytes and platelets
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2.3 Rap抑制胎肝细胞来源的CLEC⁃2缺陷巨核细胞CD41与CD61的表达
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CD41和CD61是造血干细胞向巨核细胞系定向分化的特异高表达的膜表面糖蛋白。为了探究自噬改变对巨核细胞分化的影响，流式细胞仪检测了胎肝来源的巨核细胞表面CD41和CD61的表达。结果表明，和野生型小鼠相比，200nmol/L Rap处理的CLEC⁃2基因敲除小鼠巨核细胞CD41和CD61的双阳性率为（1.0 ± 0.1）%，显著下降（P< 0.01，图3）。
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2.4 Rap增强CLEC⁃2缺陷巨核细胞骨髓自噬基因的表达
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小鼠腹腔注射Rap，24h后取出小鼠骨髓，进行免疫荧光染色，结果表明，Rap能显著增强敲除小鼠LC3蛋白的表达，验证了CLEC⁃2的缺陷影响小鼠体内的自噬水平（图4）。
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2.5 Rap抑制胎肝来源的CLEC⁃2缺陷巨核细胞的成熟
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巨核细胞成熟的一个标志性特征是发生核内有丝分裂，为了探究CLEC⁃2的缺陷是否影响自噬紊乱导致胎肝来源的巨核细胞的核内有丝分裂，在分离胎肝细胞的第1天就加入Rap与细胞因子TPO共同孵育培养5d，诱导出巨核细胞并通过流式细胞仪进行巨核细胞分析检测（图5）。流式细胞仪的核型分析能体现巨核细胞核内有丝分裂的程度，先用CD41选出巨核细胞，然后用碘化丙啶标记细胞核。发现与对照组相比，CLEC⁃2的缺陷能显著降低自噬紊乱导致的高倍体巨核细胞（≥8N）的个数（P< 0.05）。
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图2 雷帕霉素对小鼠胎肝巨核细胞CLEC⁃2表达的影响
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Fig.2 Effects of rapamycin on the expression of CLEC⁃2in mice fetal liver megakaryocytes
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图3 流式细胞术分析CD41和CD61的表达
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Fig.3 CD41and CD61expression analyzed by flow cy⁃ tometry
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2.6 CLEC⁃2的缺陷降低Rap诱导胎肝来源的巨核细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CyclinD2的表达
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进一步探讨CLEC⁃2影响自噬的可能机制，检测跟细胞增殖相关的细胞周期蛋白以及周期监测点。检测不同处理组胎肝诱导纯化的巨核细胞的Cyclin D1、Cyclin D2蛋白，发现Rap处理胎肝巨核细胞后，CLEC ⁃2敲除小鼠巨核细胞CyclinD1、Cy⁃ clinD2的表达量比WT型小鼠低，且差异有统计学意义（P< 0.05，图6）。
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图4 小鼠骨髓的免疫荧光染色
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Fig.4 Immunofluorescence staining of mouse bone marrow
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图5 200nmol/L Rap和DMSO诱导小鼠胎肝细胞巨核细胞的核型分析
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Fig.5 Karyotype analysis of megakaryocytes induced by 200nmol/L RAP and DMSO in mice fetal liver cells
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3 讨论
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研究表明，CLEC⁃2可以通过Syk信号通路激活Plcγ2，级联放大PKC信号通路，进而活化血小板。而且，Syk信号通路已被证实参与调节巨核细胞的自噬过程。但其具体作用机制仍不明确。因此，本研究的创新之处在于应用CLEC⁃2缺陷小鼠来检测CLEC⁃2在自噬过程中是否发挥重要作用。
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研究表明在造血干细胞阶段进行药物干预自噬能造成巨核细胞CLEC⁃2表达的改变，证明CLEC⁃2参与巨核细胞的自噬过程。基因敲除小鼠模型是目前最为可靠的研究工具。本研究建立了CLEC⁃2缺陷的小鼠模型。将该基因敲除之后，巨核细胞缺失CLEC⁃2蛋白，但并不影响小鼠的生存与发育。用mTOR的抑制剂Rap处理造血干细胞诱导自噬后，胎肝细胞诱导出的CLEC⁃2敲除巨核细胞虽然自噬增强，但是巨核细胞的CD41表达以及CD41和CD61的共表达均被抑制。这表明CLEC⁃2可能调节自噬过程，即CLEC⁃2的缺陷显著抑制自噬过程中巨核细胞CD41的水平。
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图6 Rap对小鼠胎肝来源巨核细胞中Cyclin D1和Cyclin D2表达的影响
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Fig.6 Effects of rapamycin on the expression of Cyclin D1and Cyclin D2in mice fetal liver derived megakaryocytes
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本研究发现通过在巨核细胞发育的早期阶段用Rap诱导自噬后，CLEC⁃2的缺陷显著降低多倍体巨核细胞的数目，说明在Rap引起高倍体成熟巨核细胞形成受阻过程中，巨核细胞CLEC⁃2发挥重要作用。本研究结果也发现，在胎肝造血干细胞阶段干扰自噬，细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin D2的表达均下调，而CLEC ⁃2的缺陷加剧了这种反应。另外，也有其他报道表明，在造血干祖细胞中，自噬能通过调节Cyclin D3调控细胞的G1/S期转化来维持正常的造血稳态[15]。因此，巨核细胞CLEC⁃2调控自噬⁃细胞周期信号通路的关系仍需要进一步探究。
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综上，在巨核细胞自噬过程中，血小板CLEC⁃2在Rap介导的自噬中具有重要调控作用，增强自噬蛋白的表达，抑制血小板CD41的表达，影响细胞周期关键蛋白的表达。因此，本研究应用CLEC⁃2基因敲除小鼠发现，CLEC⁃2可以通过其信号通路参与调节巨核细胞自噬过程，进而影响巨核细胞的成熟发育。因此，研究CLEC⁃2是否可以通过激活其信号通路参与调节巨核细胞自噬过程，有望成为探讨巨核细胞自噬机制的新的切入点，同时也为有效治疗伴随自噬水平紊乱的血小板相关疾病提供新的靶点。
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摘要
目的：用C型凝集素样受体⁃2（C⁃type lectin like receptor 2，CLEC⁃2）缺陷小鼠检测CLEC⁃2在自噬过程中的作用，从而探究CLEC⁃2信号通路对巨核细胞发育的影响。方法：怀孕14.5 d的小鼠胚胎取出、分离并培养巨核细胞。体外雷帕霉素处理巨核细胞，检测巨核细胞CLEC⁃2和CD41的表达。小鼠经雷帕霉素处理后，检测小鼠骨髓自噬蛋白的表达。结果：自噬基因在胎肝来源的巨核细胞中表达，并且表达量很高。小鼠巨核细胞在雷帕霉素处理后，CLEC⁃2表达下调，提示CLEC⁃2参与调控自噬。雷帕霉素处理后，与野生型小鼠相比，敲除小鼠的巨核细胞CD41和CD61蛋白表达明显降低（P < 0.001）。体内实验发现雷帕霉素能显著增强敲除小鼠LC3蛋白的表达。CLEC⁃2的缺陷能显著降低自噬紊乱导致的高倍体巨核细胞数。CLEC⁃2 的缺陷降低雷帕霉素诱导胎肝来源的巨核细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin D2的表达。结论：血小板受体CLEC⁃2在巨核细胞自噬中具有重要的调控作用。
Abstract
Objective：CLEC ⁃ 2 signaling pathway is involved in the regulation of autophagy in megakaryocytes. However，the mechanism has not been fully elucidated. In this study，CLEC⁃2 deficient mice were used to detect whether CLEC⁃2 plays an important role in autophagy. Methods：Megakaryocytes were isolated and cultured from 14.5 day pregnant mouse embryos. The expression of CLEC ⁃ 2 and CD41 in megakaryocytes were detected. After rapamycin treatment，the expression of autophagy protein was detected. Results：Autophagy gene was highly expressed in megakaryocytes derived from fetal liver. After rapamycin treatment，the expression of CLEC ⁃ 2 was decreased，indicating that CLEC ⁃ 2 was involved in the regulation of autophagy. Compared with wild ⁃ type mice，the expression of CD41 and CD61 in megakaryocytes of CLEC⁃2 knockout mice was significantly decreased after rapamycin treatment. In vivo，rapamycin can significantly enhance the expression of LC3 protein in knockout mice. The defect in CLEC ⁃ 2 can significantly reduce the number of polyploid megakaryocytes caused by autophagy disorder. And it also reduced the expression of cyclin D1 and cyclin D2 in megakaryocyte derived from fetal liver induced by rapamycin. Conclusion：CLEC ⁃ 2 plays an important role in the regulation of autophagy of megakaryocytes.
关键词
C⁃型凝集素样受体2 ； 自噬 ； 巨核细胞 ； 雷帕霉素