目的：评估基于分离胶的两种前处理方法联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）直接鉴定血培养阳性病原菌的临床应用价值。方法：收集2020年5—11月南京医科大学第一附属医院血培养阳性标本302例，分离胶-皂甙法和分离胶沉淀法分别处理后对阳性血培养标本进行快速鉴定，结果分别与培养鉴定结果比较。结果：分离胶-皂甙法可在45 min内完成鉴定，分离胶沉淀法需20 min；单数菌感染标本288例，使用两方法直接鉴定的准确率均为86.81%（250/288），其中两方法分别鉴定革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阳性杆菌、真菌的准确率差异无统计学意义（P > 0.05）；复数菌感染标本14例，仅分离胶-皂甙法1例与培养鉴定结果一致，其余标本两种方法均仅可准确鉴定其中的一种细菌。结论：两种基于分离胶的前处理方法联合质谱均可直接、快速、准确地鉴定血培养病原菌，分离胶沉淀法可作为本实验室血培养快速鉴定常规的前处理方法。