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第42卷第10期 马天云，罗 超，刘龙飞，等. HMGCS1表达对食管鳞癌细胞转移能力及食管鳞癌患者预后
2022年10月 的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（10）：1357-1363，1458 ·1359 ·
3 次。滴加一抗工作液（1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS 表达水平。
洗涤 3 次。滴加二抗工作液（稀释比例为 1∶500）， 1.2.6 细胞划痕实验
37 ℃孵育 1 h，PBS 洗涤 3 次。用 DAB 显色、苏木素 先用黑色记号笔在 6 孔板背面划横线，每隔约
复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下 0.7 cm一道，横穿过孔；每孔穿过3条线。在每孔中
拍照分析。 加入5×10 个细胞。第2天用200 μL 枪头垂直于背
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1.2.2 定量逆转录PCR 后的横线划痕。用 PBS 洗细胞 3 次，清除划下的细
用 TRIzol 从培养的食管鳞癌细胞/正常食管上 胞，加入无血清培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培
皮细胞中提取 RNA，使用 Prime Script RT Master 养。按 0 h、24 h、48 h时间点取样，拍照。
Mix 反转录试剂盒将 1 μg RNA 逆转录成 cDNA，并 1.2.7 细胞迁移实验
按照 qPCR 反应体系配制反应溶液。使用 Nanodrop 将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化
2000/2000C 分光光度计测量 RNA 的浓度。用荧光 后重悬并计数，调整细胞密度至 5×10 个/mL，取细
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定量 PCR 试剂盒在 ABI StepOnePlus 实时 PCR 系 胞悬液 200 μL 加入 Transwell 小室。24 孔板下室
TM
统上进行定量 PCR 实验。程序包括预变性和循 加入 600 μL 含 10%胎牛血清的培养基，放入 37 ℃、
环。收集并处理数据，结果用2 -ΔΔCt 法计算。 5% CO2培养箱培养48 h。然后取出Transwell 小室，
1.2.3 Western blot 弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细
贴壁细胞用 RIPA 裂解液/PMSF 蛋白酶抑制剂 胞，PBS洗3遍，甲醇固定20 min。随后用0.1%结晶
进行裂解，离心后取上清。用BCA试剂盒测蛋白浓 紫染色30 min，用PBS洗3遍。并在100倍相差显微
度。SDS⁃PAGE 电泳用 5%的浓缩胶与 10%的分离 镜下随机取5个视野计数。
胶进行。电泳后将蛋白转至 PVDF 膜，用 5%脱脂 1.2.8 细胞侵袭实验
奶粉封闭。分别加入 HMGCS1 抗体、GAPDH 抗体 将 Matrigel 基质胶 1∶20 稀释，包被 Transwell 小
（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。洗涤，二抗室温孵育，洗 室底部膜的上室面，置37 ℃ 6 h ，使Matrigel 基质胶
涤，曝光显色。 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。将处于对
1.2.4 大肠杆菌质粒的提取 数生长期的各实验组细胞胰酶消化后重悬并计数，
将含 pcDNA3.1 的菌种和含 HMGCS1 CDS 区 调整细胞密度至2×10 个/mL，取细胞悬液100 μL 加
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质粒（pcDNA3.1/HMGCS1）的菌种各取 60 μL，分别 入 Transwell 小室。24 孔板下室加入 600 μL 含 10%
接种于 30 mL LB + 30 μL 氨苄青霉素培养液中， 胎牛血清的培养基，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养
37 ℃ 200 r/min摇床培养12~16 h。取10~15 mL菌液 48 h。然后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用
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室温下离心收集细菌，然后使用E.Z.N.A. Endo⁃Free 棉签轻轻擦掉上层未侵入细胞，PBS洗3遍，甲醇固
Plasmid Mini KitⅡ 试 剂 盒 ，按 照 手 册 洗 脱 出 定 20 min。0.1%结晶紫染色 20 min，用 PBS 洗 3 遍。
pcDNA3.1、pcDNA3.1/HMGCS1。使用分光光度计测 并在100倍相差显微镜下随机选择5个视野记数。
量DNA的浓度。 1.3 统计学方法
1.2.5 过表达HMGCS1食管鳞癌细胞系构建及鉴定 采用 GraphPad Prism 8 和 SPSS22.0 软件进行统
培养食管鳞癌细胞系（KYSE150、KYSE30）， 计。正态分布的计量资料采用均数±标准差（x ± s）
转染前 1 d 按 4×10 个/孔接种 6 孔板，待细胞贴 表示，两组间比较使用Student’s t检验，多组间比较
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壁至 70%~90% 进行转染；Lipofectamine TM 3000 转 使用单因素方差分析或 Dunnett⁃t 检验。计数资料
染体系（每孔）如下：分别以 Opti⁃MEMTM 培养基 采用百分比表示，使用卡方检验进行分析。生存风
125 μL+ P3000 5 μL+ pcDNA3.1/HMGCS1 2.5 μg， 险比例采用Cox多因素回归模型分析，Kaplan⁃Meier
TM
TM
TM
Opti⁃MEM 培养基125 μL+Lipofectamine 3000 5 μL （log⁃rank）用于分析患者生存预后，P < 0.05 为差异
两个预混液，各自充分混匀，室温孵育5 min；将两者 有统计学意义。
混合后室温孵育 10~15 min，加入更换了新鲜完全
2 结 果
培养基的 6 孔板中；转染 6 h 后换液，48 h 后收集细
胞。设置 pcDNA3.1 阴性对照组。经 TRIzol 试剂盒 2.1 HMGCS1在ESCC组织及细胞中的表达
裂解细胞提取总RNA，采用qRT⁃PCR检测HMGCS1 蛋白质谱显示，与未发生转移的食管鳞癌患者
的表达。抽提总蛋白，Western blot检测HMGCS1的 癌 组 织 相 比 ，发 生 肺 转 移 患 者 肿 瘤 组 织 中 有
