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第42卷第6期                 朱 敏，王红玉，陆琳娟，等. CHL1在支气管哮喘中的表达及意义［J］.
                  2022年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：796-801                       ·797 ·


                附着在基底膜上的具有细胞⁃细胞接触的极化上皮                            同期收集18例健康志愿者作为正常对照组，受试者
                转化为间充质表型，获得迁移并分泌细胞外基质                             均签署知情同意书，并通过南京医科大学第一附属
               （extracellular matrix，ECM）的过程，是哮喘气道重               医院医学伦理委员会许可。两组人群均无吸烟者，
                塑过程中的重要环节，近年来引起研究者的广泛                             且排除过敏性鼻炎、肺结核、肿瘤等病史。哮喘组
                关注 。然而目前研究大都着眼于 EMT 中上皮或                          男 11 例，女 44 例，对照组男 3 例，女 15 例，哮喘组
                    ［3］
                间充质标志物变化，关于迁移特性少有报道，其具                           （50.42 ± 1.54）岁，对照组（51.78 ± 1.41）岁，通过卡
                体机制尚未明确。                                          方检验或独立样本t检验分析发现，两组性别、年龄
                    近来研究表明，神经细胞黏附分子 L1 样蛋白                        差异无统计学意义（P=0.755、P=0.631）。
               （cell adhesion molecule L1⁃like protein，CHL1）可能    1.2  方法
                参与了上皮细胞的 EMT 过程           ［4-6］ 。现已明确，CHL1        1.2.1 临床资料和血清标本收集
                是免疫球蛋白超家族成员，是一种跨膜细胞黏附分                                入组时收集受试者临床信息（包括一般情况、
                  ［7］
                子 。CHL1 能够通过影响细胞骨架的信号转导途                          病史和既往史等），记录哮喘患者稳定期肺功能数
                径与细胞内部进行通讯，参与细胞迁移和运动 。研                           据，同期采集其血清标本。用含分离胶/促凝剂的真
                                                        ［7］
                究表明CHL1 能通过促进肿瘤细胞 EMT，与细胞侵                        空采血管分别采集晨起空腹外周静脉血5 mL，对其
                袭和转移密切相关        ［5，8］ ，且其表达水平与不良预后有               外周血行细胞分类计数。余外周血室温静置20 min，
                关 ［9-11］ ，抑制CHL1表达能减少非小细胞肺癌转移 。                   以3 000 r/min、4 ℃离心10 min，获得上层血清，检测
                                                          ［12］
                    本研究分别在人体、动物和细胞水平研究                            受试者血清CHL1和总IgE水平。
                CHL1表达及分布，并探讨其可能调控机制，了解其                          1.2.2 慢性哮喘小鼠模型构建
                在哮喘中的作用。                                              随机将动物分为两组：对照组（n=5）和哮喘组
                                                                 （n=5），分别于第0、7、14天致敏哮喘组小鼠，腹腔内注
                1  材料和方法
                                                                  射鸡卵清蛋白（ovalbumin，OVA）+氢氧化铝的混悬液
                1.1  材料                                           4 mL/kg，对照组小鼠腹腔内注射生理盐水4 mL/kg；
                    SPF级雌性6~8周BALB/c小鼠10只（北京维通                    从第16天起雾化吸入5% OVA，1周3 d，共8周。
                利华实验动物技术有限公司），饲养于南京医科大学                           1.2.3  酶联免疫吸附实验（enzyme linked immuno⁃
                动物实验基地。动物实验均按规范严格进行。人支                            sorbent assay，ELISA）
                气管上皮细胞株16HBE（购于北京肿瘤研究所）。                              采用人 CHL1 ELISA 检测试剂盒，按说明书进
                    CHL1 抗体（AF2147，R&D 公司，美国），Tubulin             行。将待测血清和试剂缓慢平衡至室温，加样（标准
                抗体（AF1216，上海碧云天生物技术有限公司），                         品及样本）100 μL至ELISA板内，37 ℃烘箱孵育1 h，
                CHL1 抗体（25250⁃1⁃AP，上海 Proteintech 公司），山           甩干，不洗板；加100 μL检测溶液A工作液，37 ℃烘
                羊抗兔二抗（GB23303，武汉塞维尔生物科技有限公                        箱孵育 1 h，洗板 3 次；再加 100 μL 检测溶液 B 工作
                司）；人源性重组细胞因子 IL⁃4（BK0245）、IL⁃17                   液，于37 ℃烘箱孵育30 min，洗板5次；加入TMB底
               （BK0234）、IL⁃1β（BK0094）（Bioworld 公司，美国）、            物溶液 90 μL，37 ℃烘箱避光显色 10~20 min；待标
                IL⁃13（213⁃ILB/CF，R&D公司，美国）、TGF⁃β（100⁃21，          准孔蓝色深度合适时，加50 μL终止溶液，置于酶标
                PeproTech公司，美国），SYBR（Q311⁃02，南京诺唯赞                仪中，450 nm波长检测每孔光密度值。
                生物科技股份有限公司）；人CHL1 ELISA检测试剂                       1.2.4 免疫组化
                盒（SEQ118Hu，武汉云克隆科技股份有限公司），                            最后1次OVA 激发后24 h处理小鼠，取每只小
                RNA 快速提取试剂盒（上海奕杉生物科技有限公                           鼠右下肺最大横径处肺组织，采用石蜡切片机进行
                司），逆转录试剂盒（R222⁃01，南京诺唯赞生物科技                       连续切片。石蜡切片置于烘箱脱蜡 60 ℃烘 2 h，依
                股份有限公司），ECL 化学发光超敏显色试剂盒                           次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ浸泡切片 20 min，后梯度浸泡
               （36208ES76，上海翌圣生物科技股份有限公司）                         于 100%、95%、80%、75%乙醇各 5 min，最后用 PBS
                    纳入 2018 年 3 月—2019 年 11 月就诊于南京医               浸洗2次，每次5 min。置于有柠檬酸缓冲液的高压
                科大学第一附属医院呼吸内科门诊的支气管哮喘                             锅中，沸水修复2 min，冷却至室温后，用PBS冲洗2次，
                患者 55 例，所有病例诊断标准参照 2018 年全球哮                      每次5 min。室温将切片置于3%H2O2溶液15 min以
                喘防治倡议（Global Initiative For Asthma，GINA）。         灭活内源性酶，PBS冲洗3次，每次5 min。吸去组织
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