Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 16

第41卷第12期
               ·1722 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年12月


                  肺癌（亦称支气管肺癌）是一种发生于支气管
                                                                1  材料和方法
              黏膜上皮组织的恶性肿瘤，通常分为小细胞肺癌
             （small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non⁃          1.1  材料
                                               ［1］
              small cell lung cancer，NSCLC）两大类 。由于绝大                 人正常支气管上皮细胞系 BEAS⁃2B 和 3 种
              多数肺癌患者属于NSCLC（约为85%），加上近年来                        NSCLC 细胞系（H1703、PC9、H1299）均由武汉大学
              NSCLC 的发病率和病死率呈逐年升高的趋势 ，故                         中国典型培养物保藏中心提供。人 C5a 蛋白（R&D
                                                       ［2］
              深入探讨 NSCLC 的病因和发病机制具有十分重要                         Systems 公司，美国），抗C5aR 抗体（武汉Abclonal 公
              的意义。                                              司），抗 总 Akt1（t ⁃ Akt1）、磷 酸 化 Akt1（p ⁃ Akt1，
                                                         ［3］
                  NSCLC的形成不仅与遗传和环境等因素有关 ，                       Ser473）、总 ERK1/2（t⁃ERK1/2）、磷酸化 ERK1/2（p⁃
              而且还与肿瘤局部微环境中的某些促炎因子（如                             ERK1/2，Thr202/Tyr204）、总 PKC⁃α（t⁃PKC⁃α）、磷酸
              TNF⁃α和IL⁃6）和补体（如C3a和C5a）的作用明显相                    化 p⁃PKC⁃α（p⁃PKC⁃α，Thr638）的抗体（Cell Signal⁃
              关 ［4-5］ 。研究发现，补体 C5a 不仅可由补体系统 3 条                 ing Technology 公司，美国）。HRP 标记山羊抗兔和
              途径激活时产生，还可由肿瘤组织本身产生 。肿                            山 羊 抗 鼠 二 抗（合 肥 Biosharp 公 司）。 Perifosine
                                                      ［6］
              瘤局部微环境中的补体C5a通过其C5a受体（C5aR）                       （Akt1抑制剂）和U0126（ERK1/2抑制剂）（上海MCE
              作用于靶细胞，既能调节免疫应答，又能促进肿瘤                            公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Wisent
                           ［7］
              的生长和转移 。NSCLC 患者血浆和癌组织中C5a                        公司，加拿大）。DMEM（Gbico 公司，美国）。CCK⁃8
              含量明显增多，并能促进 NSCLC 细胞的增殖 。本                        试剂盒（上海MCE公司）。
                                                      ［5］
              课题前期研究发现，体外用C5a 刺激NSCLC 细胞不                       1.2  方法
              仅能促进细胞的增殖还能增强细胞的迁移，但有关                            1.2.1 BEAS⁃2B、H1703、PC9和H1299细胞系的培养
              C5a 促 NSCLC 细胞增殖和迁移的分子机制，目前尚                           将前述细胞系接种于含 10% FBS 的 DMEM 完
              不清楚。                                              全培养液中，置于 37 ℃、5% CO2孵箱中培养 48 h。
                  据报道，C5a诱导靶细胞的生物学效应通常与靶                        当细胞融合度达到 90%时，按 1∶3 比例进行细胞传
              细胞内某些信号通路的活化有关，例如 C5a 可激活                         代，并继续培养。
              丝/苏氨酸蛋白激酶 Akt1、细胞外信号调节激酶 1/2                      1.2.2  BEAS⁃2B、H1703、PC9 和 H1299 细胞系 C5aR
             （extracellular signal⁃regulated kinase，ERK1/2）等 ［8-9］ 。  表达的检查
              已知，Akt1活化与多种肿瘤细胞的增殖和活化密切                               RT⁃PCR：根据 NCBI 数据库找到目的基因 CDS
              相关。Akt1可通过激活其下游分子如mTOR等促进                         区，利用 Premier 5 软件进行引物设计，并交由通用
              肿瘤细胞的增殖、迁移以及肿瘤血管的形成                    ［10］ 。此    生物系统有限公司合成。序列如下：C5aR（上游5′⁃
              外，ERK1/2是MAPK家族中重要成员。作为高度保                        ACTACAGCCACGACAAACG⁃3′；下游5′⁃CCCTAAC⁃
              守的丝/苏氨酸蛋白激酶，ERK1/2 可识别并磷酸化                        CACGGACTCTTC⁃3′），GAPDH（上游 5′⁃CAAGGT⁃
              特定的底物蛋白，在细胞的增殖与分化等活动中发                            CATCCATGACAACTTTG ⁃ 3′ ；下 游 5′ ⁃ GTCCAC⁃
              挥重要作用      ［10］ 。文献报道 C5a 可通过活化 Akt1 促            CACCCTGTTGCTGTAG ⁃ 3′）。 提 取 前 述 细 胞 总
                                  ［7］
              进乳腺癌细胞的增殖 。此外，C5a 还可通过激活                          RNA，逆转录为 cDNA，以此 cDNA 为模板，用 Prime
              ERK1/2增强肾癌细胞的增殖和侵袭能力                ［12］ 。但是，     STAR@ Max DNA Polymerase 进行PCR反应，最终扩
              有关 C5a 作用于 NSCLC 细胞后信号通路的激活情                      增产物行琼脂糖凝胶电泳，并拍照成像。
              况尚未见文献报道。                                              Western blot：将上述细胞裂解物离心 3 min，取
                  本课题的前期研究已发现，用 C5a 刺激体外培                       30 μg蛋白行 SDS⁃PAGE 电泳，先用45 V恒压浓缩，
              养的NSCLC细胞后，NSCLC细胞的增殖和迁移能力                        再用120 V电泳2 h，接着用0.3 A湿转120 min，待蛋
              均显著提高，且 Akt1 和 ERK1/2 的磷酸化水平也同                    白转印到PVDF膜上后再用脱脂奶粉溶液封闭2 h，加
              步上调，故推测 C5a 刺激 NSCLC 细胞后，可能通过                     入抗C5aR抗体4 ℃孵育过夜。漂洗后用HRP 标记
              激活Akt1或ERK1/2信号分子促进细胞的增殖和迁                        的二抗室温孵育1 h，最后行ECL化学发光试剂检测。
              移。鉴于此，本课题开展了以下实验，研究C5a激活                          1.2.3  Western blot 实 验 检 测 PC9 细 胞 中 Akt1、
              Akt1和ERK1/2促进NSCLC细胞的增殖和迁移的作                      ERK1/2、PKC⁃α磷酸化水平
              用与机制。                                                  收集C5a刺激PC9细胞后不同时间点的细胞蛋
   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21