Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 16
第41卷第12期
·1722 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月
肺癌(亦称支气管肺癌)是一种发生于支气管
1 材料和方法
黏膜上皮组织的恶性肿瘤,通常分为小细胞肺癌
(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non⁃ 1.1 材料
[1]
small cell lung cancer,NSCLC)两大类 。由于绝大 人正常支气管上皮细胞系 BEAS⁃2B 和 3 种
多数肺癌患者属于NSCLC(约为85%),加上近年来 NSCLC 细胞系(H1703、PC9、H1299)均由武汉大学
NSCLC 的发病率和病死率呈逐年升高的趋势 ,故 中国典型培养物保藏中心提供。人 C5a 蛋白(R&D
[2]
深入探讨 NSCLC 的病因和发病机制具有十分重要 Systems 公司,美国),抗C5aR 抗体(武汉Abclonal 公
的意义。 司),抗 总 Akt1(t ⁃ Akt1)、磷 酸 化 Akt1(p ⁃ Akt1,
[3]
NSCLC的形成不仅与遗传和环境等因素有关 , Ser473)、总 ERK1/2(t⁃ERK1/2)、磷酸化 ERK1/2(p⁃
而且还与肿瘤局部微环境中的某些促炎因子(如 ERK1/2,Thr202/Tyr204)、总 PKC⁃α(t⁃PKC⁃α)、磷酸
TNF⁃α和IL⁃6)和补体(如C3a和C5a)的作用明显相 化 p⁃PKC⁃α(p⁃PKC⁃α,Thr638)的抗体(Cell Signal⁃
关 [4-5] 。研究发现,补体 C5a 不仅可由补体系统 3 条 ing Technology 公司,美国)。HRP 标记山羊抗兔和
途径激活时产生,还可由肿瘤组织本身产生 。肿 山 羊 抗 鼠 二 抗(合 肥 Biosharp 公 司)。 Perifosine
[6]
瘤局部微环境中的补体C5a通过其C5a受体(C5aR) (Akt1抑制剂)和U0126(ERK1/2抑制剂)(上海MCE
作用于靶细胞,既能调节免疫应答,又能促进肿瘤 公司)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Wisent
[7]
的生长和转移 。NSCLC 患者血浆和癌组织中C5a 公司,加拿大)。DMEM(Gbico 公司,美国)。CCK⁃8
含量明显增多,并能促进 NSCLC 细胞的增殖 。本 试剂盒(上海MCE公司)。
[5]
课题前期研究发现,体外用C5a 刺激NSCLC 细胞不 1.2 方法
仅能促进细胞的增殖还能增强细胞的迁移,但有关 1.2.1 BEAS⁃2B、H1703、PC9和H1299细胞系的培养
C5a 促 NSCLC 细胞增殖和迁移的分子机制,目前尚 将前述细胞系接种于含 10% FBS 的 DMEM 完
不清楚。 全培养液中,置于 37 ℃、5% CO2孵箱中培养 48 h。
据报道,C5a诱导靶细胞的生物学效应通常与靶 当细胞融合度达到 90%时,按 1∶3 比例进行细胞传
细胞内某些信号通路的活化有关,例如 C5a 可激活 代,并继续培养。
丝/苏氨酸蛋白激酶 Akt1、细胞外信号调节激酶 1/2 1.2.2 BEAS⁃2B、H1703、PC9 和 H1299 细胞系 C5aR
(extracellular signal⁃regulated kinase,ERK1/2)等 [8-9] 。 表达的检查
已知,Akt1活化与多种肿瘤细胞的增殖和活化密切 RT⁃PCR:根据 NCBI 数据库找到目的基因 CDS
相关。Akt1可通过激活其下游分子如mTOR等促进 区,利用 Premier 5 软件进行引物设计,并交由通用
肿瘤细胞的增殖、迁移以及肿瘤血管的形成 [10] 。此 生物系统有限公司合成。序列如下:C5aR(上游5′⁃
外,ERK1/2是MAPK家族中重要成员。作为高度保 ACTACAGCCACGACAAACG⁃3′;下游5′⁃CCCTAAC⁃
守的丝/苏氨酸蛋白激酶,ERK1/2 可识别并磷酸化 CACGGACTCTTC⁃3′),GAPDH(上游 5′⁃CAAGGT⁃
特定的底物蛋白,在细胞的增殖与分化等活动中发 CATCCATGACAACTTTG ⁃ 3′ ;下 游 5′ ⁃ GTCCAC⁃
挥重要作用 [10] 。文献报道 C5a 可通过活化 Akt1 促 CACCCTGTTGCTGTAG ⁃ 3′)。 提 取 前 述 细 胞 总
[7]
进乳腺癌细胞的增殖 。此外,C5a 还可通过激活 RNA,逆转录为 cDNA,以此 cDNA 为模板,用 Prime
ERK1/2增强肾癌细胞的增殖和侵袭能力 [12] 。但是, STAR@ Max DNA Polymerase 进行PCR反应,最终扩
有关 C5a 作用于 NSCLC 细胞后信号通路的激活情 增产物行琼脂糖凝胶电泳,并拍照成像。
况尚未见文献报道。 Western blot:将上述细胞裂解物离心 3 min,取
本课题的前期研究已发现,用 C5a 刺激体外培 30 μg蛋白行 SDS⁃PAGE 电泳,先用45 V恒压浓缩,
养的NSCLC细胞后,NSCLC细胞的增殖和迁移能力 再用120 V电泳2 h,接着用0.3 A湿转120 min,待蛋
均显著提高,且 Akt1 和 ERK1/2 的磷酸化水平也同 白转印到PVDF膜上后再用脱脂奶粉溶液封闭2 h,加
步上调,故推测 C5a 刺激 NSCLC 细胞后,可能通过 入抗C5aR抗体4 ℃孵育过夜。漂洗后用HRP 标记
激活Akt1或ERK1/2信号分子促进细胞的增殖和迁 的二抗室温孵育1 h,最后行ECL化学发光试剂检测。
移。鉴于此,本课题开展了以下实验,研究C5a激活 1.2.3 Western blot 实 验 检 测 PC9 细 胞 中 Akt1、
Akt1和ERK1/2促进NSCLC细胞的增殖和迁移的作 ERK1/2、PKC⁃α磷酸化水平
用与机制。 收集C5a刺激PC9细胞后不同时间点的细胞蛋