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第41卷第12期 李兰兰,陈 欣,张恒璐,等. 长链非编码RNA ENSMUST00000127391 对小鼠肾小球系膜细胞
2021年12月 增殖和纤维化的影响[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(12):1741-1746 ·1743 ·
后,一抗孵育4 ℃过夜,次日回收一抗,用TBST漂洗 在室温避光处放置 15 min,加入 400 μL 1×Binding
PVDF 膜后加入相应的二抗,室温下孵育 1 h 后用 Buffer,混匀后在1 h内使用BD流式细胞仪检测结果。
TBST漂洗。随后曝光显影。 1.3 统计学方法
1.2.6 CCK8实验 实验结果使用 SPSS22.0 软件进行统计学分析
将 MMC 细胞分别以 2 000 个/孔的密度接种于 和作图,实验数据以均数±标准差(x ± s)表示,CCK⁃
96 孔板中,每孔加入 100 μL 完全培养基,每组设置 8实验中两组间比较采用双因素方差分析检验(two⁃
6个重复孔,共铺种5块板。放入37 ℃、5%CO2的培 way ANOVA),考虑处理条件及时间两个因素的影
养箱中培养,分别于24、48、72、96 h后取出,每孔各 响,其余两组间比较采用 t 检验,P < 0.05 为差异有
加入10 μL CCK8试剂,放入培养箱中孵育1 h,用酶 统计学意义。
标仪测定在450 nm波长处的吸光度值。
2 结 果
1.2.7 凋亡实验
将MMC细胞以5×10 个/孔的密度接种于6孔板 2.1 lncRNA 127391在DN小鼠肾组织及高糖MMC
5
中,置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h 后,按照 细胞中低表达
BD Annexin V FITC Apoptosis Kit 凋亡试剂盒说明书 db/db组小鼠血糖、体重、尿量、24 h尿蛋白定量
操作,细胞消化后离心,用预冷的 PBS 洗 2 遍,重悬 较db/m对照组小鼠均显著升高,差异均有统计学意
于 100 μL 1×Binding Buffer,随后分别加入 5 μL 的 义(P < 0. 05,表1)。
Annexin V⁃FITC 和 5 μL PI 染色,轻轻混匀细胞,并 HE 染色结果显示,与 db/m 小鼠相比,db/db 小
表1 db/m组和db/db组小鼠的特征
Table 1 Characteristics of db/m and db/db mice
组别 n 性别 周龄 血糖(mmol/L) 体重(g) 尿量(mL) 24 h尿蛋白定量(μg/24 h)
db/m 3 雄性 9 11.80 ± 0.45 23.76 ± 0.21 0.67 ± 0.12 0.20 ± 0.03
db/db 3 雄性 9 ≥33.30 36.03 ± 0.39 12.17 ± 1.55 2.86 ± 0.33
P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
鼠表现出典型的DN病理改变,其系膜基质增生、基 MMC细胞的增殖。
底膜增厚(图 1A)。RT⁃qPCR 检测 lncRNA 127391 2.4 过表达lncRNA 127391促进MMC细胞凋亡
相对表达量,结果显示,db/db 小鼠肾组织中 ln⁃ 通过流式细胞术检测细胞凋亡水平,结果显
cRNA 127391 表达显著低于 db/m 小鼠肾组织(图 示,过表达lncRNA 127391组的MMC细胞凋亡数显
1B)。且随着葡萄糖浓度的升高,MMC 细胞中 ln⁃ 著高于对照组,表示 lncRNA 127391 可能促进 MMC
cRNA 127391表达水平逐渐降低(图1C)。 细胞凋亡(图4)。
2.2 重组质粒pCDH⁃lncRNA127391转染MMC细胞
3 讨 论
将空载对照 pCDH 和 pCDH⁃lncRNA 127391 分
别转入MMC细胞后培养48 h,荧光显微镜观察到绿 lncRNA 是一类参与多种生物学进程和疾病发
色荧光表达(图2A)。RT⁃qPCR结果显示,转染重组 展的非编码 RNA,其既可以定位于细胞核,也可以
质粒 pCDH⁃lncRNA127391 后,MMC 细胞中 lncRNA 定位于细胞质。核 lncRNA 可通过多种方式介导表
127391表达量显著高于对照组(图2B)。 观遗传调控,包括表观转录和转录后修饰,调控方
2.3 过表达 lncRNA 127391 抑制 MMC 细胞增殖和 式包括染色体修饰、转录干扰或转录激活。细胞质
纤维化 中的 lncRNA 可以起到分子海绵的作用,与 microR⁃
蛋 白 质 免 疫 印 迹 结 果 显 示 过 表 达 lncRNA NA结合,间接增强蛋白质的表达 [17-18] 。多项研究表
127391 后,MMC 细胞中纤维化标志物 FN、Col⁃1 的 明,lncRNA 影响了多种癌症的发展。有学者发现,
蛋白表达量和增殖标志物 CyclinD1、PCNA 的蛋白 lncRNA PCAT19 可以促进前列腺癌生长、侵袭和转
表达量显著降低(图 3A)。CCK8 实验结果显示,过 移 [19] 。在另一项研究中,研究人员发现,lncRNA
表达 lncRNA 127391 组的 MMC 细胞增殖速度低于 REG1CP 结直肠癌中表达显著上调,促进结直肠癌
对照组(图 3C)。结果表明 lncRNA 127391 可抑制 发生 [20] 。lnc00491可促进食管鳞癌细胞增殖和抑制