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第41卷第12期
·1742 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿 1.2 方法
病的主要并发症之一,是终末期肾病的主要原因, 1.2.1 动物实验
增加了糖尿病患者的死亡率 。DN 的病理特征主 8周龄雄性C57BL/KSJ 小鼠购自南京大学动物
[1]
要表现为肾小球肥大,基底膜增厚,足细胞凋亡,细 模式研究所,分为db/db组和db/m对照组,适应性喂
胞外基质沉积等。研究表明,30%~40%的糖尿病患 养 1 周后,测量体重血糖并用 ELISA 法检测 24 h 尿
者并发DN。DN的发病因素多样,包括高血糖、晚期 白蛋白定量(UAE),待 db/db 小鼠 UAE 显著升高
糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ、氧化应激和促炎 时,取小鼠肾组织,并行 HE 及 PAS 染色,确定 DN
[2]
细胞因子等 。由于DN具体发病机制较为复杂,目 诊断 [16] 。本研究经南京医科大学动物护理与伦理
前尚不明确,治疗方法有限,主要包括控制血糖、控 委员会批准实施。
制血压和控制血脂等,但众多 DN 患者仍然不可避 1.2.2 细胞培养
免地发展为终末期肾病 ,因此,探索 DN 的发病机 为了模拟正常与糖尿病生理环境,将MMC细胞
[3]
制和寻找其治疗靶点至关重要。 分别培养在葡萄糖浓度为 5、15、25 mmol/L 并含有
长 链 非 编 码 RNA(long non ⁃ coding RNA,ln⁃ 10%胎牛血清的完全培养基中,置于 37 ℃、5%CO2
[4]
cRNA)是长度>200 个核苷酸的非编码长链 RNA 。 的细胞培养箱中培养,每 2~3 d 换新鲜培养基。取
研究表明,lncRNA 是多种生物过程的重要调节因 生长良好的3~8代细胞行功能试验。
子,广泛参与了增殖、纤维化、凋亡等生物学过程, 1.2.3 质粒转染
在乳腺癌、骨肉瘤和胃癌等癌症疾病和糖尿病等代 将 MMC 细胞分成对照组(pCDH)和过表达 ln⁃
谢性疾病中发挥了重要作用 [5-9] 。Yin 等 [10] 发现 ln⁃ cRNA127391 组(lncRNA127391)。将 MMC 细胞按
5
cRNA TUG1可以调节胰岛β细胞功能,降低incRNA 每孔1×10 个细胞的密度接种于6孔板中,每孔加入
TUG1 的表达后β细胞凋亡率增加,胰岛素分泌减 2 mL DMEM培养基。置于37 ℃、5%CO2的细胞培养
少,从而调节糖尿病的发生。目前,lncRNA在DN中 箱中静置过夜培养。按照 Lipofectamine 2000 说明
TM
[6]
[11]
的作用也逐渐显现 ,它可从影响肾纤维化 、介导肾 书,将pCDH和pCDH⁃lncRNA127391分别转入MMC
[12]
脏炎症 、调节肾小球系膜细胞的增殖和凋亡 和足 细胞中,置于细胞培养箱中静置培养6 h后,更换为
[13]
细胞损伤 [14] 等多方面参与DN的发生发展。本课题 完全培养基,置于培养箱中继续培养 48 h 后,在荧
组前期通过 lncRNA 芯片对 DN 小鼠和正常对照小 光显微镜下观察,并收取细胞进行后续试验。
鼠的肾组织进行差异 lncRNA 筛选,发现 lncRNA 1.2.4 RT⁃qPCR试验
127391 在 DN 小鼠中较正常小鼠表达显著降低,因 TRIzol 试剂提取细胞和组织的总 RNA。按照
此推测 lncRNA127391 可能在 DN 发生中发挥重要 HiScript Ⅱ Q RT SuperMix(南京诺唯赞)试剂盒说
作用,并于前期成功构建重组质粒 pCDH⁃lncRNA 明书行逆转录反应生成 cDNA,参照 ChamQ SYBR
127391 [15] 。 本 研 究 将 重 组 质 粒 pCDH ⁃ lncRNA qPCR Master Mix(南京诺唯赞)试剂盒说明书行
127391 转染小鼠肾小球系膜细胞(mice mesangial PCR 扩增,扩增条件:预变性 95 ℃ 30 s;循环反应
cell,MMC)细胞,并观察MMC 细胞的增殖和纤维化 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共 40 个循环;熔解曲线 95 ℃
等指标的变化。 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。LncRNA 127391 上游引
物 :5′ ⁃ GCTCTAGAGCTATGATTTTTTTCATTGTAG⁃
1 材料和方法
GTGAGCTCC ⁃ 3′ ,下 游 引 物 :5′ ⁃ CGGGATCCC⁃
1.1 材料 GGGATATTCATGTTGCTT⁃3′;β⁃actin 上游引物:5′⁃
MMC(中国科学院上海细胞库);DMEM 培养 GTGACGTTGACATCCGTAAAGA⁃3′,下游引物:5′⁃
基、胎牛血清(Gibco 公司,美国);Lipofectamine TM GCCGGACTCATCGTACTCC⁃3′
2000 脂质体(Invitrogen 公司,美国);抗 FN 抗体、抗 1.2.5 蛋白质免疫印迹
α⁃Tubulin抗体(Abcam 公司,美国);抗Col⁃1、抗 Cy⁃ 在细胞样本中加入适量配制好的含有PMSF的
clinD1 抗 体 、抗 PCNA 抗 体(Proteintech 公 司 ,美 蛋白裂解液,置于冰上,每10 min涡旋10 s,涡旋3次
国);CCK8 试剂盒(Dojindo 公司,日本);Annexin V 后,4 ℃、13 000 r/min 离心 15 min,吸取上清至新的
FITC Apoptosis Kit 凋亡检测试剂盒(BD 公司,美 1.5 mL EP 管中。将蛋白样品用 SDS⁃PAGE 电泳分
国)。 离后,转至 PVDF 膜,用 5%脱脂奶粉溶液封闭 1 h