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第41卷第12期 周子欣,杨旭乐,张 许,等. 去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究[J].
2021年12月 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(12):1735-1740 ·1737 ·
100 μL氯仿)。向管内加入等量异丙醇,轻柔混匀, 牛奶溶液,将PVDF膜浸入,室温封闭60 min。
静置10 min,10 000 g离心10 min,弃上清保留沉淀, 取出预先以1%BSA抗体稀释液配置的一抗,置
加入预冷的75%DEPC乙醇,10 000 g离心10 min洗 于冰上,将 PVDF 膜置于塑封膜内,加入一抗,热合
涤RNA沉淀,弃上清,晾干至乙醇挥发。加入DEPC 封闭塑封膜,置于摇床上,4 ℃过夜,使一抗与目的
水溶解沉淀,并使用仪器Nano drop测浓度。 蛋白充分结合。次日,取出 PVDF 膜,回收抗体、洗
逆转录体系如下:总RNA 1 μg 与DEPC 水共计 膜,并配置二抗。室温条件下,使 PVDF 膜结合二
5.5 μL,反应液(5×)2 μL,RNA 酶抑制剂(20 U/μL) 抗,孵育 1 h,并洗膜。将 ECL 发光液均匀滴加在
0.5 μL,dNTP 混合液(10 mmol/L)1 μL,随机引物 PVDF膜上,曝光。
0.5 μL。逆转录程序如下:95 ℃预变性 1 min,95 ℃ 1.3 统计学方法
变性10 s,60 ℃退火延伸1 min,返回上一步循环40次, 数据均使用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计
95 ℃变性1 min。取出cDNA样品,置于4 ℃保存。 分析,并作图。所示数据均以均数±标准差(x ± s)的
Q ⁃ PCR 体 系 如 下 :互 补 DNA(cDNA)1 μL, 形式表示。组间比较采用Student t检验,P<0.05为
SYBR Green染料5 μL,上游引物(2.5 mol/L)0.75 μL, 差异有统计学意义。
下游引物(2.5 mol/L)0.75 μL,去离子水 2.5 μL。Q⁃
2 结 果
PCR程序如下:95 ℃预变性,10 min;95 ℃变性,15 s;
60 ℃退火延伸,60 s;循环40次。 2.1 短期高脂饮食降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1
1.2.4 蛋白免疫印迹法 的表达水平
匀浆机、离心机 4 ℃预冷。配制组织裂解液, 前期研究发现,高脂饮食喂养后,小鼠肝脏中
4 ℃预冷。向EP内加入500 μL裂解液,切取小鼠肝 的 YOD1 表达下降。基于此,首先检测了短期高脂
脏组织,浸入其中,并匀浆。而6孔板细胞蛋白提取 饮食的小鼠肝脏中 YOD1 的表达情况,并发现短期
步骤如下:弃培养液,预冷 PBS 溶液轻柔洗去残留 高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1表达水
培养液,加入适量裂解液,冰上裂解 30 min。随 平(图 1A)。接下来,又检测了遗传性肥胖的 db/db
后,10 000 g 离心 10 min,转移上清至洁净 EP 管 小鼠肝脏,与db/+小鼠相比,YOD1的表达水平并未
中。使用Thermo试剂盒测定蛋白浓度,以牛血清蛋 观察到改变(图1B),提示YOD1的表达变化并非遗
白为标准品绘制标准曲线,计算得到蛋白浓度。 传因素所致。为了进一步明确YOD1是否受营养状
配制 10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶,过夜后使用。 态调节,利用单不饱和脂肪酸油酸(oleic acid,OA,
将上样缓冲液(5×)与蛋白样品混匀,金属浴95 ℃加 200 μmol/L)处理Hepa1⁃6细胞16 h后,通过使用Q⁃
热 10 min,蛋白充分变性后置于冰上,并逐一上样。 PCR 检测 YOD1 的表达水平,发现经过 OA 处理后,
调节电压至80 V,待样品通过浓缩胶后,增加电压至 细胞内的YOD1表达水平显著下降(图1C)。
120 V,继续电泳。结束后转膜,预先裁剪PVDF膜, 2.2 YOD1的表达水平受营养状态调控
甲醇激活后使用,贴合膜布与凝胶,并除气泡,以湿转 为 了 明 确 YOD1 的 组 织 分 布 情 况 ,提 取 了
“三明治”结构,在100 V、1 h的条件下转膜。配制5% C57BL/6小鼠多个组织器官的RNA。利用Q⁃PCR的
A 1.5 B 1.2 C 1.5
mRNA相对表达量 1.0 * mRNA相对表达量 0.8 mRNA相对表达量 1.0 *
YOD1 0.5 YOD1 0.4 YOD1 0.5
0 0 0
正常饮食 高脂饮食 db/+ db/db OA(-) OA(+)
A:Q⁃PCR检测C57BL/6小鼠高脂饮食4周后肝脏组织中YOD1的mRNA水平,两组比较,P<0.05(n=8);B:Q⁃PCR检测正常饮食的8周龄
*
db/db小鼠肝脏组织中YOD1的mRNA水平(n=6);C:Q⁃PCR检测200 μmol/L油酸处理Hepa1⁃6细胞16 h后,细胞中YOD1的mRNA水平,两组
比较,P<0.05(n=3)。
*
图1 短期高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中的YOD1的表达水平
Figure 1 Short⁃term HFD could reduce the expression level of YOD1 in the liver of C57BL/6 mice