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第41卷第12期
·1736 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月
毒或其他明确病因的情况下,肝细胞内出现中性脂 观察细胞内脂质堆积情况,检测下游相关基因,为
肪堆积,主要为甘油三酯。作为一类进行性疾病, 进一步揭示去泛素化酶YOD1在肝脏脂质代谢中的
NAFLD 的病程可由非酒精性脂肪性肝炎发展为肝 功能及作用提供新的实验数据。
硬化、肝细胞癌,直至死亡 [1-3] 。肝脏作为脂类代谢
1 材料和方法
的重要脏器,是脂肪酸、胆固醇和脂蛋白合成的枢
纽,若β⁃氧化、极低密度脂蛋白分泌、脂肪酸合成等 1.1 材料
生物途径发生改变,或外周血非酯化脂肪酸(non⁃es⁃ db/db 雄性小鼠、C57BL/6 雄性小鼠(北京维通
terified fatty acid,NEFA)增加,均可引起脂肪肝。 利华实验动物技术有限公司),实验动物的使用及
不仅如此,肝脏脂代谢过程还受到更复杂的分 操作均获得南京医科大学伦理委员会批准(批准编
子网络调节。研究表明,固醇调节元件结合蛋白 号:IACUC⁃1901025)。抗 Calnexin 抗体(Stress gen
(sterol regulatory element⁃binding proteins,SREBP)家 公司,加拿大),抗Flag抗体、抗SREBP⁃1c抗体(Cell
族包含由 2 个基因编码的 3 种蛋白。其中,SREBP1 Signaling公司,美国),抗Insig⁃1抗体(Abcam公司,美
基因在不同的启动子作用下可编码产生 SREBP⁃1a 国);蛋白marker(Bio⁃Rad 公司,美国);TRIzol、转染
TM
和SREBP⁃1c,而SREBP2基因则编码SREBP2。Shi⁃ 脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen公司,美国);
[4]
momura 等 发现,SREBP⁃1c 是 SREBP 分布在小鼠 引物由上海捷瑞基因有限公司合成;甘油三酯检测
和人类多个组织内的主要形式,在肝脏、白色脂肪、 试剂盒(北京普利莱生物公司);RevertAid First
骨骼肌、肾上腺及脑组织中高表达,参与脂肪酸和 Strand cDNA Synthesis Kit 逆 转 录 试 剂 盒(Thermo
甘油三酯代谢;而 SREBP⁃1a 则主要分布在脾脏及 Fisher 公司,美国);SYBR Green Ⅰ Master(Roche 公
小肠组织,参与调控细胞增殖及脂质代谢。SREBP 司,瑞士);脱脂奶粉(青岛MDBio公司);Hepa1⁃6细
在剪切后发挥作用。在内质网上,SREBP与SREBP 胞(ATCC 细胞库,美国);腺病毒(上海汉恒生物科
裂解激活蛋白(SREBP cleavage⁃activating protein, 技有限公司);60 kcal% 高脂饲料(D12492)(Re⁃
SCAP)结合形成复合体,经过外壳蛋白复合物(coat search Diets公司,美国)。
protein complex Ⅱ,COPⅡ)介导的囊泡运输,转移至 1.2 方法
高尔基体,先后经过蛋白酶S1P、S2P的剪切,形成具 1.2.1 动物分组和处理
有活性的 SREBP 剪切体。多种脂质摄取及合成酶 选取4周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为正常饮
序列的启动子含有固醇调节元件(sterol regulatory 食组及高脂饮食组,每组各8只,喂养4周后摘取肝
element,SRE),SREBP 剪切体入核后可与 SRE 相结 脏组织 [11] 。对8周龄C57BL/6雄性小鼠进行饥饿再
合,从而调节脂代谢 [4-5] 。 喂食造模 [12] ,分别给予小鼠如下处理:正常饮食、饥
既往报道显示,去泛素化酶 YOD1 是卵巢肿瘤 饿 24 h 以及饥饿 24 h 后再喂食 12 h,每组随机纳入
相关蛋白酶(OTU)家族的一员,其UBX结构域可与 6只小鼠,处理结束后摘取小鼠肝脏。
含缬酪肽蛋白 VCP(又称 P97 或 CDC48)形成复合 1.2.2 Hepa1⁃6细胞培养和处理
[6]
物,使折叠错误的蛋白从内质网上分离 。在酵母 在 5% CO2 的 37 ℃的环境下,给予 Hepa1⁃6 细
细胞中,YOD1 的同源异构体 OUD1 可被 VCP 招募, 胞 10%胎牛血清的高糖 DEME 培养基培养。以
使转录因子STP23(哺乳动物NF⁃κB的同源物)去泛 pcDNA3.3质粒为载体,构建YOD1过表达质粒。使
素化而活化,从而调节酵母细胞内不饱和脂肪酸的 用 Opti ⁃ MEM 培 养 基 稀 释 脂 质 体 Lipofectamine TM
稳态 [7-8] 。除了脂肪酸代谢外,研究还发现,YOD1参 2000 与质粒,Lipofectamine TM 2000 与质粒按照 2∶1
与了免疫调节及肿瘤免疫等多种生物过程 [9-10] 。本 的比例分别配置转染液并混匀,加入细胞培养基
实验室前期研究发现,高脂饮食喂养后,小鼠肝脏 内,转染细胞4~6 h后换液。
中的 YOD1 表达下降。本研究为了探索 YOD1 在肝 1.2.3 RNA提取和实时荧光定量PCR(Q⁃PCR)
细胞营养代谢中的作用,分别检测了短期高脂饮食 匀浆机、离心机 4 ℃预冷。将 1 mL TRIzol 加入
小鼠、db/db小鼠肝脏中以及经OA处理后的Hepa1⁃ 匀浆管内,置于冰上预冷。切取小鼠肝脏,加入
6细胞内YOD1的表达水平,并观察了其在小鼠体内 TRIzol 中匀浆。向匀浆管内加入200 μL氯仿,剧烈
的组织分布以及小鼠在不同营养状态下的表达情 震荡30 s,并静置5 min。12 000 g离心30 min,转移
况,并在Hepa1⁃6细胞中过表达YOD1,经OA处理后 上清至洁净EP管中(细胞RNA提取:500 μL TRIzol,