Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 32
第41卷第12期
·1738 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月
100 μL氯仿)。向管内加入等量异丙醇,轻柔混匀, 牛奶溶液,将PVDF膜浸入,室温封闭60 min。 方法检测白色脂肪组织、棕色脂肪组织、肝脏、骨骼 A 40
静置10 min,10 000 g离心10 min,弃上清保留沉淀, 取出预先以1%BSA抗体稀释液配置的一抗,置 肌、肾脏和胰腺中 YOD1 的 mRNA 水平,发现 YOD1 *
加入预冷的75%DEPC乙醇,10 000 g离心10 min洗 于冰上,将 PVDF 膜置于塑封膜内,加入一抗,热合 在肝脏中表达丰度最高(图 2A),进一步提示 YOD1 ( mg/g蛋白 ) 30
涤RNA沉淀,弃上清,晾干至乙醇挥发。加入DEPC 封闭塑封膜,置于摇床上,4 ℃过夜,使一抗与目的 可能在肝脏中发挥重要作用。为验证YOD1是否参 20
水溶解沉淀,并使用仪器Nano drop测浓度。 蛋白充分结合。次日,取出 PVDF 膜,回收抗体、洗 与肝脏中的营养代谢,对 C57BL/6 小鼠进行禁食后 甘油三酯 10
逆转录体系如下:总RNA 1 μg 与DEPC 水共计 膜,并配置二抗。室温条件下,使 PVDF 膜结合二 再喂食处理,并观察到禁食24 h后,小鼠肝脏YOD1
5.5 μL,反应液(5×)2 μL,RNA 酶抑制剂(20 U/μL) 抗,孵育 1 h,并洗膜。将 ECL 发光液均匀滴加在 表达水平显著升高,再喂食后又显著下降(图 2B)。 0 空载对照组 YOD1过表达组
0.5 μL,dNTP 混合液(10 mmol/L)1 μL,随机引物 PVDF膜上,曝光。 上述结果提示,YOD1受营养状态调控,并可能参与 B 空载对照组 YOD1过表达组
0.5 μL。逆转录程序如下:95 ℃预变性 1 min,95 ℃ 1.3 统计学方法 肝脏营养代谢。
变性10 s,60 ℃退火延伸1 min,返回上一步循环40次, 数据均使用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计 2.3 过表达 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞中 OA 诱导的脂
95 ℃变性1 min。取出cDNA样品,置于4 ℃保存。 分析,并作图。所示数据均以均数±标准差(x ± s)的 质堆积明显减少
Q ⁃ PCR 体 系 如 下 :互 补 DNA(cDNA)1 μL, 形式表示。组间比较采用Student t检验,P<0.05为 为了进一步探索 YOD1 在肝细胞中的功能,通
SYBR Green染料5 μL,上游引物(2.5 mol/L)0.75 μL, 差异有统计学意义。 过构建YOD1质粒,在Hepa1⁃6细胞中过表达目的基
下游引物(2.5 mol/L)0.75 μL,去离子水 2.5 μL。Q⁃ 因,并给予Hepa1⁃6细胞OA处理。通过甘油三酯试
2 结 果
PCR程序如下:95 ℃预变性,10 min;95 ℃变性,15 s; 剂盒检测细胞中甘油三酯含量,结果显示与空载对 使用脂质体将 YOD1 质粒转染进入 Hepa1⁃6 细胞后,使用
200 μmol/L 的 OA 处理 Hepa1⁃6 细胞 16 h。A:利用甘油三酯试剂盒
60 ℃退火延伸,60 s;循环40次。 2.1 短期高脂饮食降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1 照组相比,过表达 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞内,甘油三
检测 Hepa1⁃6 细胞内甘油三酯含量,两组比较,P<0.05(n=3);B:
*
1.2.4 蛋白免疫印迹法 的表达水平 酯含量显著降低(图 3A)。同时,对经过 OA 处理后 Hepa1⁃6 细胞经过 OA 处理后,使用 10%多聚甲醛固定细胞,异丙醇
匀浆机、离心机 4 ℃预冷。配制组织裂解液, 前期研究发现,高脂饮食喂养后,小鼠肝脏中 的 Hepa1⁃6 细胞进行油红染色,镜下观察到过表达 溶液漂洗,使用油红染料在室温下染色10 min(×20)。
4 ℃预冷。向EP内加入500 μL裂解液,切取小鼠肝 的 YOD1 表达下降。基于此,首先检测了短期高脂 YOD1 的 Hepa1⁃6 细胞内,脂滴数量明显减少,且体 图3 过表达YOD1使OA处理后的Hepa1⁃6细胞内脂质明
脏组织,浸入其中,并匀浆。而6孔板细胞蛋白提取 饮食的小鼠肝脏中 YOD1 的表达情况,并发现短期 积亦变小(图3B),与细胞内甘油三酯含量的变化趋 显减少
步骤如下:弃培养液,预冷 PBS 溶液轻柔洗去残留 高脂饮食可降低C57BL/6小鼠肝脏中YOD1表达水 势相一致。 Figure 3 YOD1 overexpression reduced OA⁃induced lipid
培养液,加入适量裂解液,冰上裂解 30 min。随 平(图 1A)。接下来,又检测了遗传性肥胖的 db/db A accumulation in Hepa1⁃6 cell line
后,10 000 g 离心 10 min,转移上清至洁净 EP 管 小鼠肝脏,与db/+小鼠相比,YOD1的表达水平并未 2.4 过表达YOD1抑制SREBP⁃1c的剪切
中。使用Thermo试剂盒测定蛋白浓度,以牛血清蛋 观察到改变(图1B),提示YOD1的表达变化并非遗 4 由于过表达YOD1后,Hepa1⁃6细胞内的甘油三
白为标准品绘制标准曲线,计算得到蛋白浓度。 传因素所致。为了进一步明确YOD1是否受营养状 mRNA相对表达量 5 3 酯含量显著下降,且脂质堆积明显减少。因此,初步
配制 10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶,过夜后使用。 态调节,利用单不饱和脂肪酸油酸(oleic acid,OA, 2 推测,过表达YOD1后,可能引起Hepa1⁃6细胞中脂质
将上样缓冲液(5×)与蛋白样品混匀,金属浴95 ℃加 200 μmol/L)处理Hepa1⁃6细胞16 h后,通过使用Q⁃ YOD1 1 合成减少。根据文献报道,SREBP家族的蛋白分子
热 10 min,蛋白充分变性后置于冰上,并逐一上样。 PCR 检测 YOD1 的表达水平,发现经过 OA 处理后, 0 SREBP⁃1c作为转录因子,经过剪切入核后,通过结合
棕色脂肪组织
调节电压至80 V,待样品通过浓缩胶后,增加电压至 细胞内的YOD1表达水平显著下降(图1C)。 肝脏 骨骼肌 肾脏 胰腺 启动子含有SRE序列的下游基因,可以激活乙酰辅酶
120 V,继续电泳。结束后转膜,预先裁剪PVDF膜, 2.2 YOD1的表达水平受营养状态调控 白色脂肪组织 A羧化酶、脂肪酸合成酶以及甘油⁃3⁃磷酸酰基转移酶
甲醇激活后使用,贴合膜布与凝胶,并除气泡,以湿转 为 了 明 确 YOD1 的 组 织 分 布 情 况 ,提 取 了 B 等关键酶,从而促进脂肪酸及甘油三酯的合成 。
[4]
mRNA相对表达量 4 3 2 用 OA(200 μmol/L)处理16 h后,通过蛋白免疫印迹
“三明治”结构,在100 V、1 h的条件下转膜。配制5% C57BL/6小鼠多个组织器官的RNA。利用Q⁃PCR的 * ** 据此,首先在Hepa1⁃6细胞内过表达YOD1并使
法检测其表达效率,可知YOD1过表达成功(图4A)。
进一步检测细胞内SREBP⁃1c的mRNA水平,与空载
YOD1 1 对照组相比,过表达YOD1后,SREBP⁃1c的总mRNA
0 水平并未观察到变化(图4B)。由于SREBP⁃1c蛋白
正常饮食 禁食 禁食后喂食 需要先后在内质网、高尔基体上经过剪切,才能以
[4-5]
A:Q⁃PCR检测YOD1的组织分布情况;B:Q⁃PCR检测正常饮食、 具有活性的剪切体形式入核发挥作用 。接下来,
进一步通过蛋白免疫印迹法检测SREBP⁃1c的蛋白表
禁食 24 h、禁食后再喂养 12 h 的 C57BL/6 小鼠肝脏组织中 YOD1的
达水平,发现过表达YOD1后,SREBP⁃1c前体的表达
mRNA水平,两组比较,P<0.01,P<0.001(n=6)。
*
**
图2 YOD1在C57BL/6小鼠肝脏中的表达受营养状态调控 水平没有变化,但是SREBP⁃1c剪切体表达水平明显
Figure 2 The expression of YOD1 in C56BL/6 mice was 降低(图 4C)。提示过表达 YOD1 抑制 SREBP⁃1c 的
regulated by nutritional status 剪切,从而影响下游脂代谢。