Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第4期
               ·478 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年4月


              在卵巢功能中的参与尚不清楚。                                    ⁃R：5′⁃GCTGCAGCAAGGGCCATTCGCGG⁃3′。CRIS⁃
                  Ninjurins家族蛋白分子量为16~27 kDa，在哺乳                PR/Cas9 在体外转录和显微注射根据文章所述                 ［15-16］ ，
              动物中有 Ninjurin1（Ninj1）和 Ninjurin2（Ninj2）两个         将 Cas9 mRNA 和 sgRNA 同时注射到合子期受精卵
              成员，两者共享保守的疏水区跨膜结构域，均可促                            中，然后移植到假孕小鼠子宫，最终通过杂合突变
              进施万细胞和背根神经节神经元轴突生长                        ［7- 9］ 。  雌雄小鼠之间的交配得到纯合敲除小鼠。
              Ninj1广泛存在于成年和胚胎组织中，特别是具有上                         1.2.2 基因型鉴定
              皮起源的组织，并在其他组织的形成和功能中发挥                                 剪取小鼠脚趾 1~2 mm 进行基因型鉴定，Ninj2
              作用，例如神经元发育以及神经再生                 ［9-14］ 。Ninj2 在  基因型鉴定引物如下，msNinj2⁃F：5′⁃GCTGTCACT⁃
              所有感觉神经节神经元和肠神经元中均表达丰富，并                           GTCACCCAAGA ⁃ 3′ ，msNinj2 ⁃ R：5′ ⁃ CACCCAT⁃
                                                    ［7］
              且神经损伤后Ninj2在施万细胞中表达上调 。通过                         GGGATATGAGGAG⁃3′。PCR反应条件：95 ℃ 5 min
              查询 PubMed 数据库发现 Ninj2 基因在卵巢中高表                    预变性；95 ℃ 30 s变性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延
              达，我们猜测 Ninj2 可能参与神经系统对卵巢功能                        伸，重复40个循环；72 ℃ 10 min终延伸；4 ℃保存。
              的调控。因此，本研究拟通过 CRISPR/Cas9 技术构                     1.2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）
              建敲除小鼠模型，研究 Ninj2 在小鼠卵巢发育中的                             用 TRIzol 提取小鼠卵巢总 RNA，利用 Super⁃
              调控作用。                                             Script Ⅲ反转录酶将 500 ng 总 RNA 反向转录成
                                                                cDNA；使用SYBR Green Master Mix进行实时荧光定
              1  材料和方法
                                                                量 PCR 检测基因表达情况。Ninj2 上游引物：5′⁃
              1.1  材料                                           GCAAAGTCCTGAAGGATGCAC⁃3′，下游引物：5′⁃
                  C56BL/6J 小鼠饲养于南京医科大学实验动物                      TAAAGAGCGCCACGTCTAGC ⁃ 3′；GAPDH 上游引
              中心（批准编号 IACUC⁃1705008），按照无特定病原                    物：5′⁃AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA ⁃ 3′，下游引
              体（SPF）条件，室温保持在（23 ± 2）℃，室内相对湿                     物 ：5′ ⁃ GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACT ⁃ 3′ 。 使 用
              度在（50 ± 5）%，小鼠饲养于12 h光照和12 h黑暗交                   ABI 7500 仪器进行PCR反应：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，
              替环境。所有动物实验经南京医科大学实验动物                             60 ℃ 60 s，40 个循环；4 ℃保存。每个样品均重复
              福利伦理审查委员会批准。                                      3 个反应。根据公式2         -ΔΔCT 计算Ninj2 mRNA表达量。
                  TRIzol、SuperScript Ⅲ 反 转 录 酶（Invitrogen 公     1.2.4 体外受精（in vitro fertilization，IVF）
              司，美国）；SYBR Green Master Mix（南京 Vazyme 公                3~4 周龄雌鼠注射马 PMSG；46 h 后注射 HCG，
              司）；琼脂糖（南京擎科公司）；DDX4 抗体（1∶200，                     提前备好获能、受精、清洗以及 KSOM 培养液滴；
              Abcam公司，英国）；荧光二抗Alexa Fluor 488⁃conju⁃            HCG注射后12 h先将精子获能，从附睾及输精管挤
              gated AffiniPure Goat Anti⁃Mouse IgG（H+L）（Jackson  出精子放入获能液滴，放入培养箱获能 1.5 h；显微
              ImmunoResearch，美国）；人输卵管液（human tubal              镜下将雌鼠输卵管放入石蜡油中，用针尖戳破输卵
              fluid，HTF）、Embryo Max Advanced KSOM Embryo        管膨大部，使卵丘团溢出，移至受精液滴；将获能后
              Medium（KSOM）（Sigma 公司，美国）；牛血清白蛋白                  的精子取5~10 μL精液放入受精液滴，记下时间，受
             （bovine serum albumin，BSA）（上海翊圣公司）；绒毛              精3~5 h后，观察受精情况，将受精卵在洗液清洗后
              膜促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，          转入KSOM培养液滴，放入培养箱中进行培养。

              PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（human chorionic go⁃                    获能及受精液滴：按照HTF 1 mL+0.01 g BSA的
              nadotropin，HCG）（宁波第二激素厂）；EDTA 抗原修                 比例进行称量溶解，涡旋混匀，0.22 μm滤器过滤。
              复液（上海碧云天）；DAPI（Invitrogen 公司，美国）；                 1.2.5 HE染色
              LPS（北京索莱宝公司）。PCR引物及sgRNA序列均                            组织切片脱蜡水化后用双蒸水清洗 3 次，每次
              由安徽通用公司合成。                                        5 min，然后在苏木素中浸染2~3 min，伊红染色 4 min，

              1.2  方法                                           梯度酒精脱水后树脂封片。
              1.2.1 构建敲除小鼠模型                                    1.2.6 免疫荧光染色
                  取成年C57BL/6J小鼠6只（雄性2只，雌性4只）                         培养后的卵巢组织在 10%中性福尔马林溶液

              构建Ninj2敲除小鼠模型。设计sgRNA序列，sgRNA                     中室温固定过夜。石蜡包埋后 5 μm 厚度连续切
              ⁃F：5′⁃CCAAGAAGAGTGTGGCAGAGAGC⁃3′，sgRNA            片。切片组织进行脱蜡、水化；EDTA 抗原修复液
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