Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第4期 尚彦星，周 蒙，鄂裘恺，等. 神经损伤诱导蛋白2在卵巢发育中的作用［J］.
2021年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：477-482 ·479 ·

95 ℃水浴修复20 min，自然冷却至室温；PBS 洗 3次， terol，TC）、肌酐（creatinine，CREA）、谷酰转氨酶（γ⁃
每次 5 min；然后用 10% 山羊血清室温封闭 2 h；轻 glutamyl transpeptidase，GGT）、葡 萄 糖（glucose，
轻甩掉片子上多余水分，滴加 10% 山羊血清配制的 GLU）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipopro⁃
一抗DDX4置于湿盒内，4 ℃孵育过夜；次日，用PBS tein cholesterol，HDL⁃C）、低密度脂蛋白胆固醇（low⁃
彻底冲洗切片后用免疫荧光二抗室温孵育 2 h，PBS density lipoprotein cholesterol，LDL⁃C）、乳酸脱氢酶
洗 3 次，每次 5 min。DAPI 染细胞核 15 min，PBS 清 （lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（su⁃
洗后加防淬灭剂进行封片。用激光共聚焦显微镜 peroxide dismutase，SOD）、甘 油 三 酯（triglyceride，
采集图像。 TG）、尿酸（uric acid，UA），共14项指标。
1.2.7 小鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露 1.3 统计学方法
6周龄的雌性野生型小鼠和纯合敲除小鼠各5只， 应用SPSS19.0对数据进行统计分析，定量数据
腹膜内注入100 μg血清型超纯LPS（溶解于100 μL生 用均数±标准差（x ± s），两组间比较采用 t 检验，多
理盐水），处理以 5 d 为 1 个周期，共处理 4 次，在最 组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统
后一次处理结束的第 5 天收样进行检测相关指标。 计学意义。
通过摘眼球取血的方法采集小鼠全血，室温静置
2 结 果
后，离心分离血清，使用血液生化仪检测相关生化指
标，包括丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase， 2.1 构建Ninj2基因敲除小鼠

ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotrans⁃ 通过 qPCR 对不同组织来源的 Ninj2 mRNA 水
ferase，AST）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌 平进行了验证，结果与数据库一致，Ninj2 在卵巢中
酸激酶（creatine kinase，CK）、总胆固醇（total choles⁃ 高表达（图1A）。随后，借助CRISPR/Cas9 技术构建

A 160 B Ninj2
mRNA表达水平 120
140
100
80
60
Ninj2 40 0 ATGCCACCAAGAAGAGTGTGGCAGAGAGCATGCTAGACGTGGCGCTCTTTATGTCCAATGCCATGCGGCTGAAATCAGTGCTGCAGCAAGGGCCATTCGCGGAGTACTAC（WT）
sgRNA⁃F
sgRNA⁃R
20
心 肝 肺 脾 肠 肾 卵巢 睾丸 ATGCCACCAAGAA∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶ATTCGCGGAGTACTAC（-81）
C D
mRNA表达水平 1.2
1 2 3 4 WT HZ 1.6 *
525 bp
444 bp 0.8
Ninj2 0.4 0

Ninj2 +/+ Ninj2 -/-
A：Ninj2 基因在不同组织表达情况（n=3）；B：Ninj2基因敲除策略，黑色下划线表示sgRNA的识别位点；C：PCR鉴定4只雌雄杂合交配子代
新生小鼠的基因型，其中1、3、4号小鼠为杂合子，2号为纯合子，WT：Ninj2 野生型，HZ：Ninj2 杂合子；D：qPCR验证Ninj2敲除效果（两组比较，
P < 0.001，n=3）。
*
图1 Ninj2基因表达情况与敲除小鼠构建
Figure 1 Ninj2 gene expression and construction of knock out mice

了 Ninj2 基因敲除小鼠（图 1B）。对 4 只子代新生小 明显差异（表1），通过对Ninj2敲除小鼠的生化指标
鼠（编号为1~4）进行基因型鉴定，并结合qPCR检测 进行测定，结果表明，与野生型相比，6周龄Ninj2纯
Ninj2敲除效率（图1C、D），结果均证明Ninj2敲除鼠 合敲除雌鼠血清中 ALT、GLU、BUN、TC、UA 等指标
构建成功。 无明显差异，说明纯合敲除小鼠健康状况良好。

2.2 Ninj2敲除小鼠全身表型分析 2.3 Ninj2敲除小鼠生育信息分析
首先，我们取6周龄野生型和Ninj2纯合敲除雌 对 Ninj2 缺失的小鼠出生比例进行统计，发现
鼠各 5 只，纯合敲除鼠卵巢体重比与野生型小鼠无 敲除小鼠出生比例符合孟德尔遗传定律（图2A）；通