Page 14 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第4期
               ·484 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年4月


                  肽基脯氨酰顺/反异构酶NIMA互作蛋白1（pep⁃                     PBS（Gibco公司，美国）；葡萄糖、碱性成纤维细胞生
              tidyl⁃prolyl cis/trans isomerases，NIMA⁃interacting1，  长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、Accutase、
              PIN1）能特异性识别磷酸化的丝氨酸/苏氨酸⁃脯氨                         HEPES Buffer、Progesterone、Putrescine、Heparin、二
              酸（pSer/Thr⁃Pro）基序并与其结合，通过催化磷酸化                    甲基亚砜、多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；B⁃27
              底物的顺反异构来调节酶的活性、蛋白质的稳定性                            Growth Supplement、胰岛素铁硒传递蛋白（ITSS）、胰
              或目的蛋白的亚细胞定位。PIN1 的表达受到严格                          酶（Invitrogen公司，美国）；层黏连蛋白（Roche公司，
              的调控，其表达失调在许多病理状态下发挥着重要                            德国）；PX330（Addgene 公司，美国）；DH5α感受态、
              的作用，尤其是癌症及多种神经退行性疾病。在大                            质粒中提试剂盒（北京天根生化科技公司）；DNA
              多数癌症中 PIN1 呈高度表达状态并促进了癌症的                         Marker DL2000、pMD18 ⁃ T 载 体（TaKaRa 公 司 ，日
              发展，在多数神经退行性疾病中，PIN1 表达却被下                         本）；胶回收试剂盒（Qiagen公司，德国）；Bbs Ⅰ限制
                ［1］
              调 。据报道，PIN1激活超过50种癌症信号通路，并                        性内切酶（New England Biolabs 公司，美国）；Basic
              下调超过20种肿瘤抑制因子及生长抑制因子 。在                           Nucleofector kit 和细胞电转仪（Lonza 公司，德国）；
                                                      ［2］
                                                                           TM
              神经元中，PIN1可抑制神经纤维缠结和β⁃淀粉样蛋                         Mix Taq 酶（南京诺唯赞公司）；Mouse anti⁃Nestin
              白斑块的形成，从而阻止阿尔兹海默症的发生 。                            （BD Biosciences 公司，美国）；Chicken anti⁃Beta Ⅲ
                                                         ［3］
              在神经干细胞的发育后期，PIN1通过抑制β⁃catenin                     Tubulin（Chemicon 公司，德国）；Goat anti⁃Chicken
              的降解，调控成体神经干细胞（neural stem cell，NSC）               IgY Alexa Fluor 488（Sigma公司，美国）；Goat anti⁃rab⁃
                    ［4］
              的分化 。而在氧化应激或谷氨酸兴奋性毒性中，抑                           bit IgG Alexa Fluor 594、Goat anti ⁃ mouse IgG Alexa
                                                ［5］
              制PIN1的表达可促进神经细胞的存活 。这些结果                          Fluor 488（Abcam 公司，英国）；Rabbit anti ⁃ PIN1、
              表明PIN1在与氧化应激相关的神经系统疾病中发挥                          Mouse anti⁃β⁃actin（Proteintech公司，美国）；DAPI（Te⁃
              着重要的作用。                                           dia 公司，美国）；SurePAGE 预制胶（南京金斯瑞公
                                                                                        TM
                  NSC 具有高度的自我更新能力、多向分化潜能                        司）。
              和迁移能力，当神经系统受到损伤，如神经退行性                            1.2  方法
              疾病、缺血缺氧损伤时，NSC可以增殖、迁移、分化为                         1.2.1 NSC的体外分离、培养
                                                  ［6］
              新生神经细胞，以代偿结构和功能损伤 。因此在                                 根据张正卫 体外培养 NSC 的方法予以改进，
                                                                               ［8］
              NSC 的体外培养条件下，对其分子调节机制、中枢神                         取8周小鼠断头处死，用75%酒精消毒后，在无菌条
              经系统疾病模型及神经组织工程的研究具有重要的                            件下取出大脑。将大脑置于预冷的PBS中进行纵切，
                  ［7］
              价值 。CRISPR/Cas9 基因编辑技术由于载体构建                      并于显微镜下分离侧脑室下区外两侧壁。将分离的
              简单、靶向位点选择灵活等优点，被广泛用于各类                            组织放置于预冷的无血清培养基中，用剪刀充分剪碎
              细胞的基因编辑，通过 CRISPR/Cas9 技术对 NSC 特                  后，离心 350 g 5 min，取出上清，加入 0.05%胰酶于
              定基因进行编辑，可在体外揭示相关基因对NSC的                           37 ℃培养箱中消化成单个细胞，加入胰酶终止剂终
              影响及其功能，并为基因分析提供重要的依据。但                            止消化后离心350 g 5 min，取出上清，加入NSC无血
              目前针对成体NSC的靶向基因编辑鲜有报道。                             清培养基（DMEM/F12、6 mg/mL 葡萄糖、5 mmol/L
                  本实验通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对成体                     HEPES Buffer、2 μmol/L Progesterone、0.6 μmol/L
              NSC 的PIN1基因进行敲除，测定基因敲除效率及蛋                        Putrescine、1 × B ⁃ 27 Growth Supplement、0.02 μg/mL
              白表达水平，并对PIN1敲除NSC特征性标志物巢蛋                         EGF、0.005 μg/mL bFGF、10 μg/mL ITSS、1.8 μg/mL
              白（Nestin）的表达、分化能力进行了初步研究，为后续                      Heparin），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
              利用条件敲除的小鼠模型研究PIN1基因在成体神经                          1.2.2 NSC的传代与培养
              发生和神经系统疾病发生、发展中的作用打下基础。                                原代NSC于无血清培养基中每2~3 d进行半量
                                                                换液，7 d左右可形成神经球。吸取原代神经球于离
              1  材料和方法
                                                                心管中，离心 300 g 5 min，取出上清，加入 500 μL
              1.1  材料                                           Accutase，轻柔吹打后置于 37 ℃热台消化 3 min，离
                  8周龄C57BL/6小鼠，由南京医科大学医药实验                      心500 g 5 min，取出上清后加入500 μL无血清培养
              动物中心提供，实验经南京医科大学实验动物福利                            基吹打至单个细胞。将单细胞悬液置于 12 孔板中
              伦理委员会批准。DMEM/F12 培养基、胎牛血清、                        进行悬浮培养。此后每2~3 d进行半量换液，5 d左
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