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第41卷第4期         胡廷栋，王     蒙，刘晓蕊，等. 利用CRISPR/Cas9建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系［J］.
                  2021年4月                   南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：483-488，521                     ·485 ·


                右进行传代。                                            中，涂菌，挑取单克隆菌落进行测序。将野生型序
                    NSC 单层贴壁培养：将包被液（200 μg/mL 多聚                  列与测序结果对比得到敲除基因型。
                赖氨酸、0.25 μg/mL层黏连蛋白）加入至12孔板，于                     1.2.5 Western blot验证敲除效果
                37 ℃培养箱中包被过夜，次日超净台中去除包被                               分别提取PIN1敲除NSC和野生型NSC的蛋白，
                液，干燥 30 min，PBS 清洗 3 遍。将 NSC 单细胞悬液                加热变性后，等量上样，采用 120 V 电压进行电泳，
                       5                                          使待检测蛋白进入最佳分辨区。将转膜槽置于冰
                以 5×10 个/mL 的密度接种于包被的孔板中，约 2 h
                NSC 贴壁。此后每 2~3 d 进行半量换液，约 5 d NSC                 中，采用湿转法，经250 mA、90 min将凝胶上的蛋白
                可长满培养皿，对其进行传代。                                    转移至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h
                1.2.3 sgRNA的设计与CRISPR/Cas9载体构建                    后，孵育一抗Rabbit anti⁃PIN1（1∶1 000），4 ℃摇床过
                    根 据 NCBI 数 据 库 中 小 鼠 PIN1（Gene ID：            夜，次日取出，PBST 清洗 3 遍，加入二抗（1∶5 000），
                23988）的 基 因 序 列 ，使 用 sgRNA 在 线 设 计 软 件            室温摇床孵育 1 h 后 PBST 清洗 3 遍，加入 ECL 结合

               （https：//zlab.bio/guide⁃design⁃resources），针对 PIN1  1 min，暗室曝光。
                的第 2 个外显子设计 sgRNA，PIN1⁃sgRNA⁃F：5′⁃                1.2.6 PIN1敲除NSC PIN1的免疫荧光染色
                CACCGAGCCAGTGGGAGCGGCCCAG ⁃ 3′ ，PIN1 ⁃                将 PIN1 敲除 NSC 和野生型 NSC 进行单层贴壁
                sgRNA⁃R：5′⁃AAACCTGGGCCGCTCCCACTGGCTC⁃             培养，待 NSC 贴壁完全后，去除培养基，预冷的 4%
                3′，进行 5′端磷酸化修饰，并在两端加上可与 BbsⅠ                      多聚甲醛室温固定30 min，PBS清洗3遍，加入0.5%
                酶切位点相连接的黏性末端（由南京金斯瑞生物公                            的 Triton X⁃100 通透 5 min 后，PBS 清洗 3 遍，10%
                司合成）。                                             山羊血清室温封闭 1 h，加入一抗 Rabbit anti⁃PIN1
                    经引物退火、BbsⅠ酶切 PX330 载体使其线性                    （1∶500），4 ℃摇床过夜，PBST 清洗 3 遍，加入 Alexa
                化，线性化的 PX330 载体与 sgRNA 连接构建 CRIS⁃                 Fluor 594标记二抗（1∶200），室温摇床避光孵育1 h，
                PR/Cas9载体，然后将载体转化进入DH5α中，涂布于                      PBST清洗3遍，荧光显微镜下观察、拍照。
                LB固体培养基进行培养，37 ℃过夜。次日挑取单克                         1.2.7 PIN1敲除NSC Nestin的免疫荧光染色
                隆菌落，扩增培养后提取质粒并进行测序。                                   将PIN1敲除的NSC进行单层贴壁培养，待NSC
                1.2.4 细胞转染及单克隆细胞的获得及鉴定                            贴壁完全后，去除培养基，预冷的4%多聚甲醛室温
                    取成球状态的NSC，传代分散成单细胞悬液，加                        固定30 min，PBS清洗3遍，加入0.5%的Triton X⁃100
                入无血清培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养                       通透5 min后，PBS清洗3遍，10%山羊血清室温封闭
                2 h。按照 Lonza 转染试剂盒说明书配制核转液，后                      1 h，加入一抗Mouse anti⁃Nestin（1∶500），4 ℃摇床过
                加入 2 μg PIN1⁃Cas9⁃sgRNA 及 2 μg 的 PGK/puro 抗       夜，PBST 清洗 3 遍，加入 Alexa Fluor 488 标记二抗
                性质粒。调整细胞量至 2×10 个，加至核转液中重                        （1∶200），室温摇床避光孵育1 h，PBST清洗3遍，荧
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                悬。将细胞悬液转移至电转杯，放入 Lonza 核转仪                        光显微镜下观察、拍照。
                杯槽内，选择 T⁃030 程序进行转染。转染结束后将                        1.2.8 PIN1敲除NSC的定向分化测定
                细胞悬液转移至2 mL的无血清培养基中，轻轻吹打                              将PIN1敲除的NSC进行单层贴壁培养，并将培
                分散均匀后，转移至 6 孔板中进行培养。转染 24 h                       养基换为神经元诱导分化培养基（在无血清培养基基
                后用含有 0.6 μg /mL Puro 的无血清培养基进行培                   础上，去掉EGF，bFGF浓度降低一半，加入1 μmol/L
                养。每 2 d 进行半数换液，约 5 d 后，可获得单细胞                     视黄酸 和1% FBS）继续培养，约10 d后吸除培养基，
                克隆的神经球，利用吸卵针在显微镜下随机吸取神                            加入0.2%的Triton X⁃100通透5 min后，PBS清洗3遍，
                经球至96孔板中进行传代。待传代至12孔板后，挑                          10%山羊血清室温封闭 1 h，加入一抗 Chicken anti⁃
                取3/4细胞冻存，1/4 细胞用 NP40 裂解提基因组，进                    Beta Ⅲ Tubulin（1∶500），4 ℃摇床过夜，PBS清洗3遍，
                行TA 克隆鉴定细胞基因型。将提取的基因组进行                           加入 Alexa Fluor 488 标记二抗（1∶200），室温摇床避
                PCR 扩增，反应条件为预变性 95 ℃ 5 min，变性                     光孵育1 h，PBST清洗3遍，荧光显微镜下观察、拍照。
                95 ℃ 30 s；退火 56 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35 个循
                                                                  2 结 果
                环；总延伸 72 ℃ 7 min，4 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳
                后切胶回收，用胶回收试剂盒提取胶回收产物，再                            2.1 NSC体外培养形态
                与 pMD18⁃T 载体连接，将连接产物转化进入 DH5α                         8 周龄小鼠大脑纵切，分离侧脑室下区外两侧
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