Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第4期
·486 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年4月

壁，剪碎消化后于无血清培养基中培养。7 d左右大
多数组织细胞死亡，NSC 可存活并分裂成团形成
NSC球（图1A）。在无血清培养基中，NSC呈悬浮状
态；在多聚赖氨酸和层黏连蛋白处理的培养皿中，
NSC变为单层贴壁细胞（图1B）。
2.2 CRISPR/Cas9敲除位点选择和打把载体构建
使用sgRNA在线设计软件，针对PIN1 的第2个
外显子设计 sgRNA（图 2A）。将 sgRNA 与 PX330 载 A B
A：悬浮培养神经球；B：贴壁培养单层神经干细胞。
体质粒连接后，进行测序，结果显示sgRNA与PX330
图1 8周龄小鼠神经干细胞体外培养形态（×100）
成功连接（图2B）。 Figure 1 Morphology of cultured adult neural stem cells
2.3 PIN1基因敲除NSC克隆的获得与鉴定 from 8⁃weeks old mice（×100）
Puro 筛选 5 d 后，随机挑选了 16 个单细胞克
隆，选取其中 9 个状态好的单细胞克隆进行冻存， 疫荧光染色，结果显示，PIN1 基因敲除后的 NSC 仍
经过基因型鉴定，9 个细胞克隆均发生基因突变 为 Nestin 阳性（图 4），表明 PIN1 基因敲除后的 NSC
（表 1）。 仍然表达Nestin。

2.4 PIN1的免疫荧光染色和Western blot验证敲除 2.6 PIN1敲除NSC分化情况
效果 在分化培养基中添加视黄酸可诱导 NSC 向神
［9］
PIN1 的免疫荧光染色（图 3A）及 Western blot 经细胞定向分化 ，当单层贴壁培养的 PIN1 敲除
（图 3B）分析 PIN1 蛋白表达量，结果显示野生型 NSC 在定向分化培养基中培养时，可观察到细胞形
NSC PIN1 蛋白正常表达，而 PIN1 敲除 NSC 的 PIN1 态发生改变，大约 3 d 时，细胞生成突起，并形成网
蛋白无表达。表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可有 络，连接各个细胞。待细胞培养2周时，进行免疫荧
效敲除NSC PIN1基因，使蛋白无法表达。 光染色，结果显示，分化后的细胞大部分呈现 Beta
2.5 PIN1敲除NSC Nestin表达情况 Ⅲ Tubulin（神经元）阳性（图5），表明PIN1敲除后的
PIN1 敲除 NSC 单层贴壁培养后进行 Nestin 免 NSC仍具有分化的能力。

A B
E1 E2 E3 E4

sgRNA
CACCGAGCCAGTGGGAGCGGCCCAG

A：PIN1基因的sgRNA靶点设计；B：基因重组载体测序图。
图2 CRISPR/Cas9敲除位点选择和打把载体构建
Figure 2 CRISPR/Cas9 knockout site selection and construction of vector

表1 PIN1 神经干细胞单细胞克隆基因型
-/-
Table 1 Genotypes of neural stem cell PIN1 colonies
-/-
序号 PIN1（5′→3′） 类型
野生型 ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCAGCGGCG WT
克隆1 ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGC------------ -9 bp
克隆2、6、9 ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCC-AGCGGCG -1 bp
克隆3、8 ACGCCAGCCAGTGGGAGCGGCCCCAGCGGCG +1 bp
克隆4 ACGCCAGCCAG-------------------CGGCG -14 bp
克隆5 ACGCCAGCCAGTGG--------------------- -16 bp
克隆7 ACGCCAGC-------------------------GGCG -18 bp