Page 21 - 南京医科大学学报自然科学版

第41卷第4期 陈 绩，杨传熙，徐天华，等. 低强度脉冲式超声波对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化和吞脂能力的影响［J］.
2021年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：489-495 ·491 ·

断远端，注射器吸取培养基插入胫骨近端，冲洗出 光度计计算所得RNA浓度与纯度，于10 μL EP管中
骨髓原代前体细胞，添加 GM⁃CSF 使其成熟为原代 按总 RNA 500 ng 添加对应体积 RNA，补充适量
巨噬细胞，37 ℃、5%二氧化碳培养，隔天换液。 DEPC 水使总体积达到 8 μL，于管中加入 2 μL Syb⁃
1.2.2 LIPUS辐照细胞 rGreen qPCR Master Mix（含Rox），震荡离心，使用逆
与前期研究 ［14］ 一致，实验采用超声设备（Agi⁃ 转录仪按程序参数：35 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s 将 RNA
lent Technologies，Santa Clara，美国）发射LIPUS对巨 逆转录为 cDNA。按 2.5 μL SYBR、0.05 μL 上游引
噬细胞进行辐照处理。超声参数：频率 0.5 MHz， 物、0.05 μL 下游引物，2.4 μL cDNA 的 5 μL 体系加
电压 50~150 mVpp，声强 4.825~43.425 mW/cm ，时 样，遵循两步法程序参数设定 PCR 反应循环，95 ℃
2
长 20 min，每天 2 次，每次间隔 6 h。超声后以 LPS 10 min 进行预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循
（100 μg/mL）诱导24 h后进行下一步处理。 环，用2 -ΔΔC T 法计算目的基因的相对表达量。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡情况
将 LIPUS 辐照处理后的各组细胞移至装有 表1 PCR引物
DMEM 培养基的 15 mL 离心管中，1 000 r/min 离心 Table 1 Primers for PCR
5 min。弃上清，加预冷 PBS 重悬，1 000 r/min 离心 引物名称 引物序列（5′→3′）
5 min，重复此操作3遍后弃上清，倒置离心管，吸干 β⁃actin⁃F GGCTGTATTCCCCTCCATCG
β⁃actin⁃R CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
PBS。对照组避光加入500 μL 缓冲液，按每支流式
IL⁃1β⁃F TTCAGGCAGGCAGTATCACTC
管 100 μL 分为空白对照 1 管、单加碘化丙啶（propi⁃
IL⁃1β⁃R GAAGGTCCACGGGAAAGACAC
dium iodide PI）1 管、单加膜联蛋白 V（Annexin V）1
IL⁃6⁃F TCTATACCACTTCACAAGTCGGA
管、双加 PI/Annexin V 2 管，其余辐照处理组加入
IL⁃6⁃R GAATTGCCATTGCACAACTCTTT
200 μL 缓冲液平均分为两管，加入 PI/Annexin V。 IL⁃23⁃F CAGCAGCTCTCTCGGAATCTC
每管避光孵育 15 min，加入 300 μL 缓冲液吹打均 IL⁃23⁃R TGGATACGGGGCACATTATTTTT
匀，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 TNF⁃α⁃F CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
1.2.4 CCK⁃8法检测细胞活性 TNF⁃α⁃R CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG
将 LIPUS 辐照处理后各组细胞按每组 4 孔，每 iNOS⁃F GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA
iNOS⁃R GTGGACGGGTCGATGTCAC
孔 100 μL DMEM 培养基，每孔细胞计数 1.5×10 的
3
密度布板细胞悬液，培养箱培养 24 h。然后避光将 1.2.7 Western blot
每 孔 中 的 旧 培 养 基 换 为 10 μL CCK ⁃ 8 + 100 μL LPS（100 μg/mL）诱导 24 h 后收取蛋白，具体方
DMEM培养基的混合液，于等量空白孔里也加110 μL 法如下：蛋白裂解液按90∶1添加PMSF后，每6 cm皿
混合液用于对比参照。温箱孵育 2 h 后，使用酶标 添加80 μL蛋白裂解液，充分研磨后移液至1.5 mL EP
仪检测LIPUS辐照处理下巨噬细胞活性。 管，冰上裂解30 min，12 000 g离心15 min 去除杂质
1.2.5 LIPUS辐照热效应检测 取上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度，加入蛋白上
将培养皿放置于超声辐照探头上，确保接触紧 样缓冲液煮沸5~6 min。配制10% SDS⁃PAGE凝胶，
密。连接测温仪与测温针，测试校准后，固定测温 电泳至蛋白条带分隔清晰。分离后的蛋白转膜至
针顶端接触培养皿底部正中心，设定测温记录参数为 PVDF膜上，BSA溶液封闭2 h，于一抗中4 ℃孵育过
1 s采集2次，采集20 min，进行LIPUS热效应检测。 夜，次日于对应二抗中孵育2 h、洗脱20 min后，曝光
1.2.6 实时荧光定量PCR（qPCR） 显现蛋白条带。
LPS（100 μg/mL）诱导 24 h 后收取 RNA，进行 1.2.8 脂滴吞噬染色

PCR 检测，具体方法如下：每 6 cm 皿添加 1 mL 细胞每皿添加 2.0 mg/mL 的 DiI⁃Ox⁃LDL 3 mL，
TRIzol 试剂，充分研磨后移液至 1.5 mL EP 管，每管 避光37 ℃培养3 h后，吸尽含DiI⁃Ox⁃LDL的培养基，
添加 200 μL 氯仿震荡后 12 000 g 4 ℃离心 15 min， PBS 冲洗 3 次，4%多聚甲醛室温固定 20 min，ddH2O
移上层无色水相至另一 EP 管，加等体积异丙醇 室温冲洗5 s，每皿添加3 mL PBS。荧光倒置显微镜
12 000 g 4 ℃离心 10 min，弃上清加 75%乙醇 1 mL， 下拍摄细胞脂滴吞噬图像。
颠倒后7 500 g 4 ℃离心10 min，弃上清液，滤纸吸取 1.3 统计学方法
残留液体室温干燥10 min，沉淀溶于DEPC水，分光 所有实验均重复3次，采用 SPSS 22.0 进行统计