Page 18 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 18

第41卷第4期
               ·488 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年4月


                                                                    ［14］
              途径。本实验从8周龄的小鼠脑室下区中提取神经                            鉴定 。通过免疫荧光染色鉴定结果，可发现大部分
              干细胞，采用无血清培养基，通过悬浮培养及贴壁                            细胞仍然表达神经干细胞特征性标志物Nestin。神
              单层培养，进行传代、增殖。通过对多个代次神经                            经干细胞具有分化潜能，当从神经干细胞的无血清
              干细胞的分析，采用的培养方法可有效维持神经干                            培养基中去除生长因子后，体外培养的神经干细胞
              细胞的特性。PIN1 在多种类型的细胞中发挥着重                          逐渐开始分化，并由悬浮状态变为贴壁生长，经过
              要的作用，在细胞的增殖、分化及存活等多种生物                            10 d 左右，可分化为 3 类神经细胞：神经元、星形胶
              学过程中产生影响。PIN1不仅可作为分子开关，通                          质细胞和少突胶质细胞。分化后的神经细胞折光
              过介导构象的改变，使得特定的蛋白激活或失活                     ［1-3］ ；  性较强，分出许多突起，连接各个细胞形成网络，并
              还可在细胞的不同阶段调节多个靶点，对多个目的                            存在趋向生长的特点           ［15］ 。神经元常用的特异性抗
              蛋白的构象及功能进行调节，协同控制反应强度及                            原标志物有 NeuN、Beta Ⅲ Tubulin 及微管相关蛋白
              时间，起到分子计时器的作用              ［10］ 。在神经系统中，          等，其中 Beta Ⅲ Tubulin 为神经元及部分肿瘤细胞
              PIN1的表达不仅与细胞的增殖相关，还与神经干细                          中表达的微管蛋白，而非神经元的其他神经细胞均
              胞的分化、神经元的功能有密切关系                 ［11-13］ 。而现在     不表达，其主要表达在新生神经元中，遍布于整个
              针对 NSC 的靶向基因编辑鲜有报道，因此，建立                          突起，因此可用于神经元鉴定的特异性标志物。
              PIN1 基因敲除成体神经干细胞系对研究 PIN1 在神                      PIN1敲除的神经干细胞向神经元定向分化后，虽然
              经系统中的作用具有重要意义。                                    仍可表达神经元的特异性标志物 Beta Ⅲ Tubulin，
                  CRISPR/Cas9基因编辑技术为基因编辑创造了                     但其往神经元方向分化的能力较正常细胞是否有
              前所未有的发展机遇，由于其快速有效且相对容易                            变化，依然需要更多实验来验证，以及向星形胶质
              对特定基因进行编辑，现被广泛应用于生物、基因                            细胞和少突胶质细胞方向的分化能力也有待进一
              治疗等领域。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在神                       步研究。本实验中，通过对NSC PIN1基因的敲除及
              经干细胞中进行精确的基因编辑，将为干细胞生物                            特异性标志物 Nestin 及分化潜能的测定，为我们后
              学、神经科学和再生医学等领域提供重要的思路和                            续利用条件敲除的小鼠模型研究 PIN1 基因在成体
              机会。在本实验中，通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技                     神经发生中的作用以及参与阿尔兹海默病的发生、
              术对神经干细胞中 PIN1 基因进行敲除。测序结果                         发展的机制研究打下基础。
              显示，在设计的靶点位置会出现不同形式的碱基缺                                 CRISPR/Cas9技术在神经干细胞基因编辑具有
              失和插入突变，随机挑选并进行测序的单克隆神经                            巨大的潜力，本研究表明，利用 CRISPR/Cas9 技术，
                                                                可以在神经干细胞中进行有针对性、精确且高效的
              干细胞 PIN1 基因均发生了突变，说明 CRISPR/Cas9
              技术在神经干细胞基因编辑中的高效性。利用免                             基因编辑。通过挑选单克隆细胞，可保证细胞基因
              疫荧光染色和Western blot 对PIN1蛋白的表达进行                   型的单一稳定，为针对机制方面的体外研究提供很好
              测定，结果表明，在野生型神经干细胞中，PIN1蛋白                         的工具，CRISPR/Cas9技术在神经干细胞基因编辑方
              正常表达，而 PIN1 基因敲除后蛋白无表达，说明                         面具有非常大的可行性和良好的应用前景。
              CRISPR/Cas9基因编辑技术有效地敲除了神经干细                       ［参考文献］
              胞中PIN1基因，并抑制了其蛋白的表达。                              ［1］ ZHOU X Z，LU K P. The isomerase PIN1 controls numer⁃
                  利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在成体神经干                          ous cancer⁃driving pathways and is a unique drug target
              细胞中特异性敲除目的基因，通过基因测序、免疫                                ［J］. Nat Rev Cancer，2016，16（7）：463-478
              荧光染色及 Western blot 证实了其高效性和有效                     ［2］ CHEN Y，WU Y R，YANG H Y，et al. Prolyl isomerase
                                                                     Pin1：a promoter of cancer and a target for therapy［J］.
              性。但经过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术敲除 PIN1
              基因后的神经干细胞会有什么样的表型变化尚未                                  Cell Death Dis，2018，9（9）：883
                                                                ［3］ DRIVER J A，ZHOU X Z，LU K P. Pin1 dysregulation
              可知。神经干细胞的鉴定可通过特征性标志物
                                                                     helps to explain the inverse association between cancer
              Nestin 及分化潜能进行。Nestin 具有一般中间丝特
                                                                     and Alzheimer’s disease［J］. Biochim Biophys Acta，
              征，又被称为神经上皮干细胞蛋白，其分布在神经
                                                                     2015，1850（10）：2069-2076
              干细胞的细胞质中，呈一过性表达，当神经干细胞                            ［4］ NAKAMURA K，KOSUGI I，LEE D Y，et al. Prolyl isom⁃
              发生迁移、分化后，Nestin 便停止表达，因此其可作                            erase Pin1 regulates neuronal differentiation via β⁃catenin
              为未分化神经干细胞的抗原标志，用于神经干细胞的                                                           （下转第521页）
   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23