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第41卷第12期 何庆玲，赵晨卉，王伟民，等. C5a激活Akt1⁃ERK1/2通路促进NSCLC细胞的增殖和迁移［J］.
2021年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1721-1727 ·1723 ·

白，行Western blot检测Akt1、ERK1/2、PKC⁃α的表达 细胞，48 h 后行 CCK⁃8 实验检测细胞的增殖情况。
和磷酸化水平，方法同前。用 10 μmol/L Perifosine 结果发现，PC9 细胞的增殖随着 C5a 刺激剂量的加
或U0126分别处理PC9细胞30 min，然后加入50 ng/ 大逐渐增强，当刺激剂量为 50.00 和 500.00 ng/mL
mL C5a 共同孵育 3 h，行 Western blot 检测 Akt1 和 时，细胞增殖最为显著（图2）。
ERK1/2的表达和磷酸化。 2.2.2 不同浓度C5a刺激PC9细胞后细胞迁移能力
1.2.4 CCK⁃8实验检测PC9细胞的增殖 的改变
将PC9细胞种植于96孔板，24 h后换成无血清 分别用 0、0.05、0.50、5.00、50.00、500.00 ng/mL
DMEM 培养 24 h，接着用不同浓度的 C5a 刺激细胞 C5a刺激PC9细胞48 h后，行划痕实验检测细胞的迁
48 h，每孔加入 10 μL 的 CCK⁃8 溶液，在 37 ℃孵育 移情况。结果显示，C5a以剂量依赖性的方式促进细
40~50 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。同上 胞的迁移，其中以50.00和500.00 ng/mL剂量的效果
将细胞接种至96孔板，分别用10 μmol/L Perifosine和 最为显著（图 3）。由于 50.00 ng/mL 和 500.00 ng/mL
U0126 处理细胞 30 min，再用 50 ng/mL C5a 刺激细 C5a 刺激剂量之间细胞增殖和迁移水平无显著差
胞48 h，开展CCK⁃8实验检测细胞增殖水平。 异，故选择用50.00 ng/mL剂量开展后续的实验。
1.2.5 细胞划痕实验检测PC9细胞的迁移 2.2.3 C5a促进PC9细胞Akt1和ERK1/2的磷酸化
将 PC9 细胞接种于 6 孔板，24 h 后换成无血清 为了探讨 C5a 诱导 PC9 增殖和迁移的潜在机
DMEM 培养 12 h。通过 200 μL 移液器吸头产生细 A
BEAS⁃2B H1299 PC9 H1703
胞单层的线性伤口，用PBS清洗脱落的细胞，加入含
C5aR
1% FBS的DMEM，同时加入不同浓度的C5a继续培
养，并于24 h和48 h时观察细胞的迁移情况。同上
GAPDH
将细胞接种至 6 孔板，进行细胞划痕，用 10 μmol/L
浓度的 Perifosine 和 U0126 分别处理细胞，30 min 后 B BEAS⁃2B H1299 PC9 H1703
再用 50 ng/mL 的 C5a 处理细胞 24 h 和 48 h，观察其
C5aR —39 kDa
迁移情况。
1.3 统计学方法 β⁃actin —42 kDa
所有实验均独立重复 3 次，所得定量数据以均
A：RT⁃PCR 测定C5aR mRNA 表达；B：Western blot 检测C5aR 蛋
数±标准误（x ± sx ）表示。采用SPSS 19.0统计软件进
白表达（n=3）。
行统计学分析，多组间比较则采用单因素方差分
图 1 正常支气管上皮细胞 BEAS⁃2B 和 NSCLC 细胞系
析，Bonfferoni法进行两两比较，P < 0.05为差异有统 H1703、PC9和H1299中C5aR的表达情况
计学意义。 Figure 1 The C5aR expression in the human normal
bronchial epithelial cell line BEAS ⁃ 2B and
2 结 果
three NSCLC cell lines （H1703，PC9 and
2.1 NSCLC细胞系中C5aR的表达情况 H1299）
首先检测了正常支气管上皮细胞（BEAS⁃2B）以
3
及3种常见的NSCLC细胞系（H1703、PC9和H1299） ** **
*
中 C5aR 的表达情况。结果显示，C5aR 在 PC9 和 2
H1703 细胞中均有明显的表达，但以 PC9 细胞的表 nm ）
达水平最高（图 1），故后续实验选择了 PC9 细胞系 （ 450 D 1
进行相关实验。

2.2 C5a刺激PC9细胞后诱导细胞增殖和迁移及其 0
刺激剂量的确定 0 0.05 0.50 5.00 50.00 500.00
C5a（ng/mL）
2.2.1 不同浓度C5a刺激PC9细胞后细胞增殖能力
与0 ng/mL组比较，P < 0.05，P < 0.01（n=3）。
*
**
的变化 图2 CCK⁃8实验检测C5a刺激PC9细胞的增殖情况
在证实了 PC9 细胞高表达 C5aR 后，分别用 0、 Figure 2 C5a stimulates the proliferation of PC9 cells by
0.05、0.50、5.00，50.00、500.00 ng/mL 的C5a刺激PC9 CCK⁃8 experiment