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第46卷第8期       沈世彬，晏美俊，王 星，等. 基于OPA三元缩合反应的多功能抗菌水凝胶敷料的构建及体外性能
                  2026年8月                 研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（8）：1175-1186                   ·1177 ·


                电 镜（scanning electron microscope，SEM）（JSM ⁃       1.2.7 荧光监测
                6700F型显微镜，JEOL公司，日本）；万能试验机（In⁃                        OSN 水凝胶在交联处理后，使用氙灯光源荧光
                stron 公司，美国）；紫外⁃可见分光光度计（型号 TU⁃                    光谱仪，在石英比色皿中进行荧光原位检测。激发
                1901，北京普金杰通用仪器）；光谱仪（光源：氙灯，                        波长设定为340 nm。
                F4600 型光致发光光谱仪，日立公司，日本）；Luria⁃                    1.2.8 溶胀性能评价
                Bertani（LB）培养基（北京奥博星生物技术有限责任                          测量圆柱形OSN水凝胶（直径10 mm，高5 mm）
                公司）；SYTO9/PI 双染色试剂盒（Invitrogen公司，美                的初始湿重（W0），随后将水凝胶置于10 mL pH 7.4
                国）；酶标仪（800TS⁃1807292，BioTek公司，美国）；活               的PBS溶液中孵育，在预定时间点去除表面水分后测
                性氧（reactive oxygen species，ROS）荧光探针、激光            量溶胀水凝胶的重量（Ws）。溶胀比（swelling ratio，
                共聚焦显微镜、荧光显微镜（Leica 公司，德国）；流式                      SR）的计算方法如下：SR（%）=（Ws-W0）/W0×100%。
                细胞仪（BD 公司，美国）；流变仪、恒温细胞培养箱                         1.2.9 细胞培养和细胞迁移
               （Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；超净工作台                 将 L929 细 胞 在 添 加 了 1% PS 和 10% FBS 的
               （TD3，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。                             DMEM 培养基中进行培养，以 1×10 个/cm 的密度
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                1.2  方法                                           接种于 6 孔板中，待细胞汇合度达 90%时，使用
                1.2.1 水凝胶的制备                                      200 μL 移液枪头在培养孔底部划出水平划痕。随后
                    将 OPA、tetra⁃PEG⁃SH 和 tetra⁃PEG⁃NH 2分别溶        在对照组（仅含PBS溶液）、OPA组（仅含OPA溶液）和
                解于 pH 为 7.4 的 PBS 溶液中，置于2个样品瓶内，并                  OSN⁃1、OSN⁃2、OSN⁃3组水凝胶对应的培养孔中加入
                通过双注射器以质量分数6%的低固含量混合，制备                           相同体积的对应溶液，并将其置于细胞培养箱中，在
                出水凝胶（命名为OSN）。倒置小瓶后未观察到流动，                         37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下共同培养24 h，分别于
                则判定为水凝胶形成。                                        0、6、12、24 h 进行显微镜观察及图像采集。使用
                1.2.2 交联动力学监测                                     Image J软件对划痕区域的细胞迁移率进行量化分析。
                    使用紫外⁃可见分光光度计记录紫外⁃可见吸收                         1.2.10 活/死染色及CCK⁃8检测
                光谱随时间的变化。通过在石英比色皿中检测原                                 将L929细胞以1×10 个/cm 的密度接种于24孔
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                位凝胶化的质量分数为 1%的 OSN 水凝胶，测定交                        板，每孔加入 1 mL 含 200 μL OSN 水凝胶提取物的
                联动力学过程，实验均独立重复3次。                                 增殖培养基。培养 2 d 后，采用 CCK⁃8 试剂盒和
                1.2.3 表观形貌观测                                      Calcein⁃AM/PI 双染试剂盒检测细胞毒性。使用酶
                    测试前将样品直接经 90 s 铂金溅射镀层处理，                      标仪测量450 nm波长处的吸光度值（n=6）。
                使其表面具备导电性后，再使用SEM在5 kV加速电                         1.2.11 抑制细菌活性检测
                压下进行观察拍摄。                                             分为对照组、OPA 组、OSN1 组、OSN2 组、OSN3
                1.2.4 组织黏附性能评价                                    组；对照组仅含DMEM培养基、OPA组含OPA试剂、
                    将 500 μL 的 OSN 前体溶液共同注射于猪皮表                   OSN各组分别含OSN⁃1、OSN⁃2、OSN⁃3水凝胶。
                面，通过扭转、弯曲、折叠及水下冲洗评估其黏附性                               将MRSA和E.coli悬浮液在无菌LB培养基中稀
                能。OSN 水凝胶黏附猪皮后，通过 30 s 预压处理进                      释至 600 nm 处初始吸光度为 0.01。将细菌悬浮液
                行拉剪测试量化评估。所有测试均以10 mm/min的                        与水凝胶在 37 ℃、220 r/min 条件下共孵育 8 h。孵
                恒定速率完成。                                           育结束后，使用酶标仪测定600 nm处吸光度以评估
                1.2.5 力学性能评价                                      细菌生长情况。随后取 10 μL 经 10 倍稀释的细菌
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                    将OSN 水凝胶制备于直径10 mm、高7.5 mm的                   悬浮液均匀涂布于无菌LB琼脂平板，37 ℃培养24 h
                容器中，使用万能试验机以2 mm/min的压缩速率进                        后通过显微镜观察记录菌落生长情况（n=3）。同
                行测试。                                              时，采用 ROS 荧光探针法检测细菌内 ROS 水平：共
                1.2.6 流变学测量                                       孵育结束后，12 000 r/min、4 ℃离心5 min收集菌体，
                    将OSN水凝胶涂布在平行板上，并用硅油密封                         无菌 PBS 洗涤 2 次，重悬于 500 μL 无菌 PBS；加入
                以防止水分蒸发。在应力振幅 0.1%和 25 ℃条件                        ROS 荧光探针至终浓度 10 μmol/L，37 ℃避光孵育
                下，使用流变仪进行测量，0.1~100.0 rad/s 动态频率                  30 min，激光共聚焦显微镜（激发波长 488 nm、发射
                扫描，记录储能模量（G′）与损耗模量（G″）。                           波长 525 nm）观察并成像，以荧光强度反映胞内
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