Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第12期        吴晓光，杨传熙，张 晶，等. Alamandine通过结合MrgD受体促进大鼠皮下脂肪间充质干细胞
                 2021年12月             成脂分化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1713-1720，1727               ·1715 ·


                pro7（Bachem公司，瑞士）。                                液 100 ℃水浴变性。蛋白等量上样，经过 SDS⁃聚丙
                1.2  方法                                           烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，在含
                1.2.1 大鼠皮下间充质脂肪干细胞提取和培养                           5%BSA的TBST封闭2 h后，一抗（1∶1 000稀释）4 ℃
                    取 6~8 周 Sprague⁃Dawley（SD）大鼠腹股沟皮下             孵育过夜。TBST洗涤条带3次后，用辣根过氧化物
                脂肪，用含双抗的PBS缓冲液冲洗3次，去除脂肪组                          酶标记的二抗常温孵育2 h。再次洗涤 3~4 次，增强
                织中可见的血管和结缔组织，将脂肪组织剪成1 mm                     3    化学发光法进行蛋白显影。
                碎块。加入适量胶原酶消化液（1 mg/mL Ⅰ型胶原                        1.2.4 油红O染色
                酶，1%BSA）。37 ℃恒温摇床充分消化30 min，完全                        4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗涤3次，加
                培养基（DMEM，10%FBS）终止消化。100 目分子筛                     入过滤后的油红 O 染料（1.8 mg/mL 油红 O 和 60%
                过滤，1 000 r/min离心10 min，去除悬浮的脂肪细胞                 （V/V）溶于双蒸水的异丙醇）染色60 min。双蒸水洗
                和脂滴。PBS 洗涤离心 2 次，用 MSCM（含 5%FBS）                  涤3次后，光学显微镜下观察拍照。
                重悬。血细胞计数板计数，按5×10 个/L的浓度将细                        1.2.5 细胞内甘油三酯、总胆固醇测定
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                胞接种到60 mm培养皿中，标记为F0代。在37 ℃、                           细胞甘油三酯含量测定采用脂肪细胞分化检

                5% CO2、饱和湿度条件下培养，24 h后用预温的PBS                     测试剂盒，在大鼠 ADSC 分化 10~12 d 后，细胞用
                洗2次，加入3 mL完全MSCM培养基继续培养，每3                        PBS重复洗2次，刮除，超声处理以使悬浮液均匀化，
                d换液1次，以去除悬浮细胞。当细胞生长汇合度达                           测定细胞内甘油三酯和总胆固醇含量。用蛋白试剂

                80%时进行传代培养。取F2代细胞，开始用MADM                         盒测定这些细胞的总蛋白浓度，作为内部对照。
               （5%FBS，5%间充质干细胞脂肪分化生长因子，1%                         1.3  统计学方法
                青霉素/链霉素）培养（定义为day1）。以后每2 d换1                          采用 SPSS 22.0 进行统计学分析，所有实验均
                次培养基。                                             重复3次，结果以均值 ± 标准差（x ± s）表示，采用软
                1.2.2 ADSC干预                                      件 Graphpad prism 7 绘制图表。数据处理时，计量
                    取F2代ADSC，PBS冲洗，加无血清的DMEM培                     资料经检验，数据符合正态分布，方差齐。组间数
                养液饥饿 12 h。进行随机分组：Alamandine 不同浓                   据比较采用单因素方差分析，LSD⁃t 检验进行两两
                度组（0、0.1、1.0、10.0 μmol/L），Western blot检测AD⁃       比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
                SC中ACC、FAS、PPAR⁃γ、CEBP⁃α蛋白表达水平，油
                                                                  2  结 果
                红O染色、光镜观察脂肪细胞分化情况和细胞内甘油
                三酯、总胆固醇测定，根据得出的Alamandine最适浓                      2.1  Alamandine对大鼠ADSC有促成脂分化效应且
                度进行以下实验：Alamandine不同处理时间组：向无                      成剂量依赖性
                血清培养基中添加/不添加10 μmol/L Alamandine 分                    ADSC 向成熟脂肪细胞的转化需要多种转录因
                别处理ADSCs 1、3、6、10 d；Sham组：无血清培养基；                 子的协同调节。其中，PPAR⁃γ被认为是最基本的转
                Alamandine组：含10 μmol/L Alamandine的无血清培            录因子。在诱导分化 10~12 d 后，许多成纤维细胞
                养基；Ang Ⅱ组：含 1 μmol/L Ang Ⅱ的无血清培养                  样纺锤形大鼠 ADSC 分化成为成熟的脂肪细胞，光
                基；Ang Ⅱ+Alamandine 组：含 1 μmol/L Ang Ⅱ和            镜下可以看到成熟脂肪细胞成球形且胞质内有脂

                10 μmol/L Alamandine 的无血清培养基；Alaman⁃              滴积聚（图 1A），且随着 Alamandine 剂量的增加，脂
                dine+D⁃pro7组：含10 μmol/L Alamandine和10 μmol/L      肪细胞的数量也在增加。脂质积聚是脂肪形成程
                D⁃pro7 的无血清培养基；Ang Ⅱ+Alamandine+D⁃                度的一个指标，可通过脂滴的油红O染色进行评估，
                pro7 组：含 1 μmol/L Ang Ⅱ和 10 μmol/L Alaman⁃        还可通过直接测量细胞内甘油三酯和总胆固醇含
                dine，10 μmol/L D⁃pro7的无血清培养基。以上实验                 量进行定量评估。在分化过程中外源性施用 Ala⁃
                各重复3次。                                            mandine 显著增加了脂肪细胞的比例（图 1B），以及

                1.2.3 Western blot                                胞内甘油三酯和总胆固醇含量，与 Sham 组相比，随
                    细胞用预冷的PBS清洗2遍，加入适量新制的磷                        着Alamandine 浓度的升高，总胆固醇以及甘油三酯
                酸酶/蛋白酶抑制剂与RIPA蛋白裂解液的混合物，刮                         水平也在升高，其中 10 μmol/L Alamandine 处理组
                除细胞置于冰上充分裂解30 min，4 ℃离心20 min，收                   的总胆固醇以及甘油三酯水平最高，且差异有统计
                集上清，检测蛋白含量。蛋白定量后加入上样缓冲                            学意义（n=3，P < 0.05，图1C）。同样，Alamandine 增
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