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第41卷第12期 吴晓光,杨传熙,张 晶,等. Alamandine通过结合MrgD受体促进大鼠皮下脂肪间充质干细胞
2021年12月 成脂分化[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(12):1713-1720,1727 ·1715 ·
pro7(Bachem公司,瑞士)。 液 100 ℃水浴变性。蛋白等量上样,经过 SDS⁃聚丙
1.2 方法 烯酰胺凝胶电泳后,将蛋白转移到PVDF膜上,在含
1.2.1 大鼠皮下间充质脂肪干细胞提取和培养 5%BSA的TBST封闭2 h后,一抗(1∶1 000稀释)4 ℃
取 6~8 周 Sprague⁃Dawley(SD)大鼠腹股沟皮下 孵育过夜。TBST洗涤条带3次后,用辣根过氧化物
脂肪,用含双抗的PBS缓冲液冲洗3次,去除脂肪组 酶标记的二抗常温孵育2 h。再次洗涤 3~4 次,增强
织中可见的血管和结缔组织,将脂肪组织剪成1 mm 3 化学发光法进行蛋白显影。
碎块。加入适量胶原酶消化液(1 mg/mL Ⅰ型胶原 1.2.4 油红O染色
酶,1%BSA)。37 ℃恒温摇床充分消化30 min,完全 4%多聚甲醛固定细胞20 min,PBS洗涤3次,加
培养基(DMEM,10%FBS)终止消化。100 目分子筛 入过滤后的油红 O 染料(1.8 mg/mL 油红 O 和 60%
过滤,1 000 r/min离心10 min,去除悬浮的脂肪细胞 (V/V)溶于双蒸水的异丙醇)染色60 min。双蒸水洗
和脂滴。PBS 洗涤离心 2 次,用 MSCM(含 5%FBS) 涤3次后,光学显微镜下观察拍照。
重悬。血细胞计数板计数,按5×10 个/L的浓度将细 1.2.5 细胞内甘油三酯、总胆固醇测定
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胞接种到60 mm培养皿中,标记为F0代。在37 ℃、 细胞甘油三酯含量测定采用脂肪细胞分化检
5% CO2、饱和湿度条件下培养,24 h后用预温的PBS 测试剂盒,在大鼠 ADSC 分化 10~12 d 后,细胞用
洗2次,加入3 mL完全MSCM培养基继续培养,每3 PBS重复洗2次,刮除,超声处理以使悬浮液均匀化,
d换液1次,以去除悬浮细胞。当细胞生长汇合度达 测定细胞内甘油三酯和总胆固醇含量。用蛋白试剂
80%时进行传代培养。取F2代细胞,开始用MADM 盒测定这些细胞的总蛋白浓度,作为内部对照。
(5%FBS,5%间充质干细胞脂肪分化生长因子,1% 1.3 统计学方法
青霉素/链霉素)培养(定义为day1)。以后每2 d换1 采用 SPSS 22.0 进行统计学分析,所有实验均
次培养基。 重复3次,结果以均值 ± 标准差(x ± s)表示,采用软
1.2.2 ADSC干预 件 Graphpad prism 7 绘制图表。数据处理时,计量
取F2代ADSC,PBS冲洗,加无血清的DMEM培 资料经检验,数据符合正态分布,方差齐。组间数
养液饥饿 12 h。进行随机分组:Alamandine 不同浓 据比较采用单因素方差分析,LSD⁃t 检验进行两两
度组(0、0.1、1.0、10.0 μmol/L),Western blot检测AD⁃ 比较,P < 0.05为差异有统计学意义。
SC中ACC、FAS、PPAR⁃γ、CEBP⁃α蛋白表达水平,油
2 结 果
红O染色、光镜观察脂肪细胞分化情况和细胞内甘油
三酯、总胆固醇测定,根据得出的Alamandine最适浓 2.1 Alamandine对大鼠ADSC有促成脂分化效应且
度进行以下实验:Alamandine不同处理时间组:向无 成剂量依赖性
血清培养基中添加/不添加10 μmol/L Alamandine 分 ADSC 向成熟脂肪细胞的转化需要多种转录因
别处理ADSCs 1、3、6、10 d;Sham组:无血清培养基; 子的协同调节。其中,PPAR⁃γ被认为是最基本的转
Alamandine组:含10 μmol/L Alamandine的无血清培 录因子。在诱导分化 10~12 d 后,许多成纤维细胞
养基;Ang Ⅱ组:含 1 μmol/L Ang Ⅱ的无血清培养 样纺锤形大鼠 ADSC 分化成为成熟的脂肪细胞,光
基;Ang Ⅱ+Alamandine 组:含 1 μmol/L Ang Ⅱ和 镜下可以看到成熟脂肪细胞成球形且胞质内有脂
10 μmol/L Alamandine 的无血清培养基;Alaman⁃ 滴积聚(图 1A),且随着 Alamandine 剂量的增加,脂
dine+D⁃pro7组:含10 μmol/L Alamandine和10 μmol/L 肪细胞的数量也在增加。脂质积聚是脂肪形成程
D⁃pro7 的无血清培养基;Ang Ⅱ+Alamandine+D⁃ 度的一个指标,可通过脂滴的油红O染色进行评估,
pro7 组:含 1 μmol/L Ang Ⅱ和 10 μmol/L Alaman⁃ 还可通过直接测量细胞内甘油三酯和总胆固醇含
dine,10 μmol/L D⁃pro7的无血清培养基。以上实验 量进行定量评估。在分化过程中外源性施用 Ala⁃
各重复3次。 mandine 显著增加了脂肪细胞的比例(图 1B),以及
1.2.3 Western blot 胞内甘油三酯和总胆固醇含量,与 Sham 组相比,随
细胞用预冷的PBS清洗2遍,加入适量新制的磷 着Alamandine 浓度的升高,总胆固醇以及甘油三酯
酸酶/蛋白酶抑制剂与RIPA蛋白裂解液的混合物,刮 水平也在升高,其中 10 μmol/L Alamandine 处理组
除细胞置于冰上充分裂解30 min,4 ℃离心20 min,收 的总胆固醇以及甘油三酯水平最高,且差异有统计
集上清,检测蛋白含量。蛋白定量后加入上样缓冲 学意义(n=3,P < 0.05,图1C)。同样,Alamandine 增