Page 146 - 南京医科大学学报自然科学版

第40卷第6期41卷第3期
第
2021
·452 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2020年6月年3月

一种将蛋白定量检测转化为核酸定量检测的技术， 当两者形成的这一体系遇到目标物质时，AuNC 与
是用于检测目标蛋白或蛋白之间相互作用的特殊 淬灭基团分离，淬灭作用消失而使荧光恢复，以实
免疫分析方法。在PLA技术中，一对可识别目标蛋 现目标物质的检测（图 1） 。根据 AuNC 的这种
［24-27］
白不同抗原表位的抗体通过共价交联或者生物素⁃ 性质，Xu 等 ［24］ 设计并制备了一种基于 AuNC 和
亲和素分别与一条寡核苷酸探针（单链 DNA）相 AuNP 的新型荧光探针，用于尿液 L⁃半胱氨酸的检
连。这对抗体结合在目标蛋白的相邻表位后，加入 测。Menon 等 ［25］ 使用 BSA⁃AuNC 标记胰岛素抗体，
一段可分别与前述两个探针互补的寡聚脱氧核苷 构建了一种检出限为 1.1×10 -10 g/mL 的胰岛素检测
酸（connector oligonucleotides），在连接酶的作用下， 方法。
3段单链DNA形成的杂交分子被连接形成一条新的
DNA片段，随即通过荧光定量PCR技术对DNA进行
荧光 荧光
［19］
定量，从而实现对目标蛋白的定量检测 。2007年，
Schallmeiner 等 ［20］ 报道了一种 3PLA 技术，提升了敏
感性和检测范围；之后在 2013 年，Nong 等 ［21］ 介绍了
一种具有高特异性、样本量变化范围广（从几微升
到几毫升）的固相PLA技术。基于纳米材料的邻位
FRET
连 接 技 术（nanoparticle ⁃ based proximity ligation as⁃ FRET
［22］
say，NP⁃PLA）是由Chen等 在PLA及其衍生技术基 金纳火簇 配体 待测物质
［22］
础上开发的超灵敏检测技术。Chen等 在PLA中引 图1 基于AuNC的检测技术模式图
入纳米粒子，不再将核酸探针与抗体耦联，而是将 Figure 1 Basic principles of protein detection using AuNC
纳米粒子耦联在抗体上后，将生物素化的核酸探针
结合在纳米粒子表面空余的亲和素位点上，由此， NSET 是一种类似于FRET 的现象。AuNP 已被
NP⁃PLA 兼具了 3PLA 和固相 PLA 的优点。随后， 证明是一种高效的能量受体，当 AuNP 和荧光基团
Chen 等 ［22］ 使用这一技术完成了对人绒毛膜促性腺 接近到一定范围时，荧光基团的能量即转移至
激素（human chorionic gonadotropin，hCG）的检测和 AuNP 表面，发生荧光淬灭。两者不同之处在于
定量，其检测限低至 2.6 fmol/L，几乎是 ELISA 技术 FRET 有着严格的距离（100Å，1Å=10 -10 m）和方向限
的1 000倍。 制，而NSET的偶极⁃纳米表面传递距离可以在更长的
2.2 AuNP作标记物的蛋白检测技术 距离上具有更高的淬灭效率，因此，AuNP有机会成为
AuNP 是一种无毒、易于表面修饰、具有较高生 有机染料猝灭剂的替代品，为各种生物分析物构建可
物相容性和独特光学特性的纳米材料 ［14］ 。AuNP 由 激活的探针 ［17，23］ 。Yuan等 利用金纳米棒、四羧基苯
［17］
于其局部表面等离子共振（surface plasmon reso⁃ 基卟啉和小牛胸腺DNA（ctDNA）的相互作用开发了
nance，SPR）、表面增强拉曼散射（surface enhance⁃ 一种基于NSET的恶性肿瘤生物标志物精胺的检测
ment of Raman scattering，SERS）和荧光共振能量转 方法，实现了对尿液标本中精胺的痕量检测 。
［17］
移（Förster resonance energy transfer，FRET）等独特 在科学研究和许多疾病的早期诊断和治疗中，
的物理和光学性质被应用于诸多领域 ［23］ 。在此讨 实现检测超低水平的蛋白质标志物至关重要。在
［15］
论AuNP在蛋白质检测中的应用。 这些方法中，NP⁃PLA 和 BCA （在后文中详细介
金纳米簇（gold nanoclusters，AuNC）是一种小于 绍）将不可扩增的蛋白质检测转化为核酸检测，实
2 nm 的新型荧光材料，由 2~100 个金原子组成。根 现了蛋白质的高灵敏度检测。根据反应体系中所
据组成和大小的不同，AuNC 的发射光谱可在紫外 用的抗体不同，NP⁃PLA 和 BCA 的检测对象非常广
区到近红外区改变，利用AuNC的这一特性，可选择 泛，但同时意味着其特异性受所用抗体特异性的影
背景干扰小的波长 ［23］ 。由于 AuNC 易于聚集，因此 响；AuNP 作标记物的蛋白检测技术，利用 AuNP 的
适当的配体对于稳定其荧光和大小必不可少，常 FERT或NSET特性，构建了类似于实时荧光PCR中
用的配体有牛血清白蛋白（bovine serum albumin， 荧光探针的荧光信号系统，并以一定线性范围内荧
BSA）等 ［24-25］ 。将 AuNC 作为荧光基团，选用某种特 光强度的增量 ［24-25］ 或减量 ［17］ 反映物质间的相互作
定的物质作为淬灭基团，通过 FERT 淬灭其荧光； 用，从而实现了超低水平的蛋白质检测。