Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第8期
               ·1110 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年8月


              随着多耐药及全耐药大肠杆菌的不断出现，其引起                            斑，重复感染周期直到形成的噬菌斑大小均一。随
              的感染严重威胁着人类的生命健康                 ［2-3］ 。由于新抗       后，将纯化后的噬菌斑在纯水中稀释并在4 ℃保存。
              生素的研发周期不断变长，可用于治疗多耐药及全                                 挑取噬菌斑接种于50 mL处于对数期的宿主菌
              耐药大肠杆菌引起感染的可选抗生素非常有限，给临                           395J2 的培养液中培养 2 h，取菌液以 4 ℃ 14 000 g
                                ［4］
              床治疗带来极大困难 ，严峻的形势促使人们寻找其                           离心10 min以去除大肠杆菌菌体，采用超高速氯化
              他替代或者补充疗法治疗耐药菌引起的感染 。噬                            铯密度梯度离心法分离纯化菌液中噬菌体。
                                                      ［5］
              菌体作为一种简单易获得的天然细菌捕食者，成为                            1.2.2 噬菌体形态观察
              替代或者补充抗生素的良好选择               ［6-7］ 。                   将密度梯度离心法纯化的噬菌体vB_EcoM_RZ
                  噬菌体是地球上最丰富的物种之一，对维持自                          溶液铺于带有碳膜的铜网上吸附2 min，并用2％（w/v）
                                           ［8］
              然界生态平衡起到了巨大的作用 。同时噬菌体作                            的磷钨酸进行负染 2 min 并立即用滤纸吸干。在
              为细菌的病毒，能够感染裂解特定种类的宿主菌，                            80 kV 的 FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN 透射电子显
              可用于特异性治疗由敏感细菌引起的感染。已有                             微镜下拍摄噬菌体的显微照片。
                                                     ［9］
              大量研究表明对于由多耐药菌引起的感染 ，噬菌                            1.2.3 噬菌体一步生长曲线
              体疗法可作为抗生素的有效辅助甚至替代治疗手                                  将 大 肠 杆 菌 395J2 培 养 至 对 数 早 期（1 ×
              段之一   ［10］ 。例如，噬菌体干粉制剂对多耐药铜绿假                     10 CFU/mL）。加入噬菌体 vB_EcoM_RZ 感染复数
                                                                  8
              单胞菌菌株引起的肺部感染小鼠具有良好的治疗                             （multiplicity of infection，MOI）为 10（MOI=10），37 ℃
              效果  ［11］ ；在酒精性肝炎患者体内，噬菌体可以专门                      共培养 10 min。14 000 g 离心 1 min 收集菌体。菌
              针对杀灭溶细胞的粪肠球菌，是精确编辑肠道菌群                            体用新鲜的 LB 培养基洗涤 2 次后，重悬于 50 mL 的
              的有效方法      ［12］ 。目前一些国家正在开展有关噬菌                   新鲜LB培养基中于37℃振荡培养。每隔5 min取菌
              体治疗安全性和有效性的临床试验                 ［13］ ，噬菌体宿主       液，采用双层琼脂平板法检测菌液上清中噬菌体的
              范围狭窄，而且细菌会对噬菌体产生抗性                    ［14］ ，通过    数量。生长曲线可以帮助确定该噬菌体的潜伏期
              把多种噬菌体混合在一起组成鸡尾酒制剂能有效                             和爆发期及爆发量。
              克服噬菌体治疗的上述缺点             ［15］ 。因此，有必要分离           1.2.4 噬菌体温度稳定性
              更多新的噬菌体并阐明其基因组序列，以累积足够                                 通过恒温水浴法测定噬菌体在不同温度（4、
              数量的噬菌体储备用于制备针对特定临床耐药菌                             25、37、45、50、55、60、65 ℃）下处理60 min后的存活
              的噬菌体鸡尾酒制剂，为噬菌体治疗临床多耐药菌                            率：将 1 mL 噬菌体（10 PFU/mL）置于上述温度下，
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              及全耐药菌引起的感染奠定基础。                                   取60 min后样品测定噬菌体滴度。
                                                                1.2.5 噬菌体宿主范围及生物学特性
              1  材料和方法
                                                                     通过斑点法检测该噬菌体对不同大肠杆菌菌
              1.1  材料                                           株的感染裂解能力。将每种测试细菌的 100 μL 过
                  硫酸镁、硝酸银、乙醇、乙酸（中国国药集团）；                        夜培养的菌液添加到 3.5 mL 融化的 LB 琼脂（0.6％
              甘氨酸、氯化铯（Sigma公司，美国）；磷钨酸（北京中                       琼脂）中。然后将混合物覆盖在LB琼脂平板上。将
              镜科仪）；硫代硫酸钠、碳酸钠（上海凌峰化学）；乙                          板在室温下干燥30 min，然后将2 μL逐滴稀释的系
              酸钠（南京生兴生物）；甲醛（广东西陇科学）；琼脂                          列噬菌体裂解液滴在板表面，然后在37 ℃下孵育过
              粉（上海翊圣）。                                          夜。检查平板的菌体清除区以评估细菌裂解程度。

              1.2  方法                                           1.2.6 噬菌体的细菌挑战试验
              1.2.1 噬菌体的分离纯化                                         大肠杆菌395J2的过夜培养物分别接种于不同培

                  从南京城区污水中收集废水样本，用 0.45 μm                      养瓶中的50 mL新鲜LB肉汤中，在37 ℃ 200 r/min 培
              孔径的过滤器过滤污水样品以去除细菌。把滤液添                            养至吸光度值 D（600 nm）=0.3。然后在不同培养瓶
              加到对数早期的大肠杆菌395J2培养液中，37 ℃下培                       中分别加入不同浓度vB_EcoM_RZ 噬菌体液（MOI=
              养24 h以富集噬菌体。将培养物在4 ℃ 14 000 g 离                   0.1，MOI=1，MOI=10）。通过测量不同时间点的

              心10 min 以去除大肠杆菌菌体。以大肠杆菌395J2                      D（600 nm）来监测细菌生长情况。作为阴性对照，用
              为宿主菌，采用双层琼脂平板法检测培养中的噬菌                            SM缓冲液代替vB_EcoM_RZ噬菌体液。每隔15 min
              体。在 37 ℃下孵育过夜，观察噬菌斑并挑取噬菌                          测定D（600 nm）。
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