Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 9

第41卷第8期           张瑞阳，许 靖，于鑫焱，等. 感染多耐药大肠杆菌新噬菌体vB_EcoM_RZ的性质鉴定及
                  2021年8月           基因组学研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1109-1114，1159               ·1111 ·


                1.2.7 噬菌体vB_EcoM_RZ的基因组提取及测序                      该噬菌体正式命名为vB_EcoM_RZ。
                    将纯化的噬菌体样品用 DNase I 和 RNase A 在
                37 ℃下处理 2 h，以消化污染的细菌 DNA 和 RNA。
                然后在55 ℃下用蛋白酶K处理15 min。用TIANamp
                Bacteria DNA Kit（北京天根生物）进一步制备噬菌
                体基因组DNA。使用Illumina HiSeq 2500测序仪对
                VB_EcoM_RZ 基因组 DNA 进行测序，并使用 ABySS
                v2.0.2 软件和 GapCloserv1.12 将测序结果拼接组装
                成基因组。                                                                   A                      B
                1.2.8 噬菌体vB_EcoM_RZ的基因组分析                            A：噬菌体 vB_EcoM_RZ 的噬菌斑形态；B：噬菌体 vB_EcoM_RZ
                                                                  电镜下形态结构（× 150 000）。
                    使 用 artemis 和 Glimmer3 软 件 预 测
                                                                      图1   噬菌体vB_EcoM_RZ的噬菌斑及形态结构
                vB_EcoM_RZ 的基因组编码的开放阅读框（open
                                                                  Figure 1  Plaque and morphology of phage vB_ EcoM_RZ
                reading frame，ORF）。使用NCBI上的BLAST工具对
                蛋白主序列功能注释。使用ExPASy Compute pI/Mw                  2.2  噬菌体vB_EcoM_RZ生物学特性
                工具计算推定蛋白质的分子量和等电点。采用                                  采用一步生长实验以评估vB_EcoM_RZ的种群动
                EMBL⁃EBI 的 EMBOSS Needle 工具进行蛋白质氨基                力学（图2A）。vB_EcoM_RZ的潜伏期约为10 min。感
                酸 序 列 的 整 体 比 对 。 采 用 EasyFig 比 对                 染后30 min所有噬菌体均已释放（图2A），该噬菌体
                vB_EcoM_RZ及其亲缘关系近的噬菌体的氨基酸序                        的爆发量大约为平均每个菌体释放1.14×10 个噬菌
                                                                                                         9
                列。采用 MEGA7 对 vB_EcoM_RZ 及其相似噬菌体                   体颗粒。
                基因组之间的系统发生关系进行分析。                                     噬菌体 vB_EcoM_RZ 放置于不同温度（4、25、
                1.2.9 噬菌体vB_EcoM_RZ的结构蛋白分析                        37、45、50、55、60、65 ℃）下 60 min 后测定噬菌体的
                    采用 12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电                         滴度变化（图 2B）。结果表明，噬菌体 vB_EcoM_RZ
                泳（SDS ⁃ polyacrylamide gel electrophoresis，SDS ⁃  的生物学活性在4~45 ℃的温度范围内比较稳定，但
                PAGE）分离鉴定噬菌体颗粒中含有的蛋白质并银                           是当温度升高至 45 ℃以上时噬菌体的滴度迅速下
                染凝胶。同时，噬菌体颗粒加热变性后，通过液相                            降，表明该噬菌体在一定温度（4~45 ℃）下可保持良
                色谱⁃质谱联用技术（high performance liquid chroma⁃         好的热稳定性，因此易于保存。
                tography⁃mass spectrometry，HPLC⁃MS）分离蛋白质，             通过标准斑点试验测定该vB_EcoM_RZ噬菌体
                以胰蛋白酶进一步消化后通过Q Exactive 质谱仪分                      感染并裂解不同大肠杆菌菌株的能力。结果显示
                析 胰 蛋 白 酶 肽 。 使 用 MASCOT 引 擎 分 析 鉴 定              该噬菌体对 38 种大肠杆菌中的 13 株多重耐药性
                vB_EcoM_RZ病毒颗粒中含有的蛋白质。                           （multiple drug resistance，MDR）大肠杆菌菌株都具
                1.2.10  噬菌体 vB_EcoM_RZ 的基因组核苷酸序列                  有裂解效果，从而表明 vB_EcoM_RZ 具有相对较广
                登录号                                               的宿主谱，并提示该噬菌体可作为生物防治剂，有
                    vB_EcoM_RZ 的 基 因 组 序 列 已 上 传 到 Gen⁃           巨大的潜在应用价值。
                Bank，登录号为MW598459。                                    在 MOI=10 的条件下测试了 vB_EcoM_RZ 对菌
                                                                  株 395J2 的裂解效果。结果显示 vB_EcoM_RZ 可以
                2  结 果
                                                                  在感染 2 h 后有效裂解大肠杆菌 395J2（图 2C）。总
                2.1  噬菌体vB_EcoM_RZ形态结构                            之，上述这些结果均提示了 vB_EcoM_RZ 具有较广
                    噬菌体在大肠杆菌395J2宿主菌平板上37 ℃过                      宿主范围和较强的溶菌能力，使得该噬菌体有作为
                夜培养可形成清晰的圆形噬菌斑（直径约 0.5 mm）                        生物制剂用于控制感染的巨大潜力。
               （图 1A）。在透射电子显微镜下观察纯化的噬菌体                           2.3  噬菌体vB_EcoM_RZ基因组的基本特征
                颗粒，可见其具有典型的二十面体的头部和带有可                                vB_EcoM_RZ的完整基因组由长度为170 318 bp
                收缩尾鞘的长尾，表明该噬菌体属于肌尾噬菌体科。                           的环状双链 DNA 组成，GC 含量为 40.146％。平均
                该噬菌体的二十面体头部的平均直径为100 nm，而                         基因长度为554 bp，大小范围为26~1 318个核苷酸。
                尾大约长为120 nm（图1B）。按照噬菌体命名法则                 ［16］   在 vB_EcoM_RZ 的完整基因组中预测到了 292 个推
   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14