Page 14 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第8期
               ·1116 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年8月


                  先天性甲状腺功能减退症（congenital hypothy⁃               巯基⁃1⁃甲基咪唑（2⁃mercapto⁃1⁃methylimidazole，
              roidism，CH）是新生儿常见的内分泌疾病，其发病率                      MMI）（Sigma公司，德国），mirVana miRNA 分离试剂
              为 1∶4 000~1∶2 000 。如果短期内未及时治疗，往                   盒（Ambion公司，美国），RNA纯化珠（Illumina公司，
                               ［1］
              往导致大脑发育缺陷，形成永久性的智力障碍 。                            美国），TruSeq RNA 文库制备试剂盒 v2（Illumina 公
                                                         ［2］
              甲状腺激素（thyroid hormones，TH）调控众多基因，                 司，美国），TRIzol（Gibco公司，美国），逆转录试剂盒
              分别与神经始祖细胞迁移、神经元分化、髓鞘形成、突                          （Roche 公司，瑞士），抗 CAMK4 抗体（Proteintech 公
              触传递、细胞黏附和细胞凋亡等生物学过程相关 。                           司，美国）；抗早期生长反应蛋白 3（early growth re⁃
                                                         ［3］
              近年来研究表明，环境中有害成分可通过母婴传播                            sponse protein 3，EGE3）抗 体（Santa Cruz 公 司 ，美
              途径干扰胎儿的 TH 水平，导致胎儿发育迟缓和智                          国）；抗GAPDH抗体（CST公司，美国），Neurobasal培
              能发育障碍 。                                           养基（Gibco公司，美国），HBSS平衡盐溶液（Gibco公
                        ［4］
                    2+
                                                   2+
                  Ca /钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ（Ca /calmodu⁃                 司，美国），B27（Stemcell 公司，加拿大），胎牛血清
              lin⁃dependent protein kinase Ⅳ，CAMK4）是一种多功        （Gibco 公司，美国），DMEM 高葡萄糖培养基（Sigma
              能的丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶，对细胞内Ca 的变化                          公司，德国），siRNA 转染试剂盒（广州锐博生物公
                                                     2+
              敏感，在细胞内钙（Ca ）增加时被激活。CAMK4 上                       司），抗 MAP2 抗体（Abcam 公司，英国）；驴抗鼠 Al⁃
                                  2+
              游启动子的 5′端-750 到-700 的区域为 TH 反应元                   exa488（Proteintech 公司，美国），T3（Sigma 公司，德
              件，与甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor，              国）。
              TR）作用，并受 TH 调节。在大鼠脑发育过程中，                         1.2 方法
              CAMK4 受三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）              1.2.1 CH大鼠模型的建立
              以时间和浓度依赖性的方式调控，在神经元特异性                                 为了诱导SD大鼠的先天性甲状腺功能减退，从
              基因调控中发挥重要作用 。TR 为核受体超家族                           孕鼠妊娠第9天起（E9，阴道栓出现的日期为E0）到
                                      ［5］
              的成员，其分子中含有 A~F 6 个区，组成 3 个功能                      仔鼠出生后第 21 天（P21），在孕鼠的饮用水中持续
              域。TR有若干异形体，其中TRα1、TRβ1和TRβ2可                      给予 0.02%的 MMI。对照组的孕鼠给予清洁饮用
              结合T3，为功能性受体。这3种功能性受体与T3的                          水。采用化学发光免疫分析法测定妊娠第 17 天的
              结合能够解除 CAMK4 启动子 TH 反应元件的抑制                       孕鼠及出生后第 1、7 和 21 天（P1、P7 和 P21）仔鼠血
              状态，从而介导CAMK4基因的表达。                                清TH水平。
                  在神经元中，CAMK4 是Ca 诱导基因表达的有                      1.2.2 大鼠海马转录组测序及生物信息学分析
                                          2+
                                                         ［6］
              效中介。研究表明Ca 及其信号控制树突的发育 ，                               根据生产商的操作指南，用 mirVana miRNA 分
                                 2+
              细胞内 Ca 浓度升高可导致树突形态的改变，而树                          离试剂盒从 P1、P7 和 P21 仔鼠中提取海马总 RNA。
                       2+
              突是神经元接收其他神经元信息输出和整合输入                             然后通过RNA纯化珠筛选，并进行文库构建和转录
              信号的主要地方，在学习和记忆形成过程中，突触                            组测序分析。利用 TruSeq RNA 文库制备试剂盒 v2
              连接的动态建立是其中的关键因素，因此树突形态                            构建文库，并由Illumina HiSeq 2000测序50个周期，
                                             ［7］
              的建立对神经回路的发育至关重要 。且海马作为                            通过Illumina质量过滤器保存用于序列分析。与对
              重要的学习和记忆脑功能区，含有确定的主要细胞                            照组相比，差异表达的 mRNA 被指定为大于或小
              类群以及输入和输出神经环路，是 CH 最先累及的                          于 2 倍变化的标准。参照NCBI数据库或AGRIS数据
              重要器官结构之一 ，而CH影响海马发育的分子机                           库（https：//agris⁃knowledgebase.org/）以 E 值阈值为
                               ［8］
              制尚不明确。故本课题研究 CAMK4 在 CH 大鼠中                       10 ，用 Blastx 注释基因的功能。对所有热图，基因
                                                                  -5
              表达的变化及对神经元树突发育的影响，以初步探                            都是通过 Jensen⁃Shannon 分化聚类的。利用 IPA 软
              讨CH大鼠海马神经发育异常的可能机制。                               件在差异表达基因的基础上构建一个重构的基因
                                                                网络，以研究它们的调控通路和细胞功能。
              1  材料和方法
                                                                1.2.3 定量实时聚合酶链反应（q⁃PCR）
              1.1  材料                                                用 TRIzol 制备海马或神经元的总 RNA，逆转录
                  成年孕鼠（体重 220~250 g）由南通大学实验动                    试剂盒进行逆转录，在20 μL反应体系中，包含2 μg
              物中心提供，动物实验符合3R原则并通过南通大学                           总 RNA，0.2 U/μL 逆转录酶，0.5 mmol/L dNTP 混合
              动物伦理委员会批准（审批号：S20190316⁃201）。2⁃                   物，1 μmol/L Oligo⁃dT 引物。在 q⁃PCR 检测前，将
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