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第41卷第8期 唐青英，赵 捷，李海英，等. CAMK4⁃EGR3信号轴对先天性甲状腺功能减退症大鼠海马神经
2021年8月 元树突的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1115-1120 ·1117 ·

cDNA以1∶4稀释。上海Generay公司设计和合成了 4 ℃下孵育16 h后，用PBS洗涤，加入二抗，在4 ℃下
序列特异性引物：CAMK4，正向引物 5′⁃TGGAG⁃ 孵育16 h，PBS洗涤封片后拍摄。
CAGTTGTTCT⁃3′和反向引物5′⁃CCTCGAATCTCAG⁃ 1.3 统计学方法
GTGC ⁃ 3′ ；EGE3，正 向 引 物 5′ ⁃ CTCAGATGGCTA⁃ 统计分析使用 GraphPad Prism 8 软件。采用
CAGAGAATGTG ⁃ 3′ 和 反 向 引 物 5′ ⁃ ACCAGTTG⁃ Levene 检验对数据进行正态性检验和方差分析。
GAAGGAGAGTCG⁃ 3′ 。反应的初始变性周期为 不同组间比较采用独立样本 t 检验、单因素方差分
94 ℃ 5 min，然后依次为 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 析及 Bonferroni 检验。所有数据以均数±标准差（x
30 s，共 45 个循环。在每个退火步骤中记录荧光。 ± s）表示。P < 0.05为差异具有统计学意义。
每次 PCR 运行结束后，系统自动分析数据，得到扩
2 结 果
增图。将这些基因的表达量归一化为内源性的
GAPDH的cDNA。 2.1 先天性甲状腺功能减退引起的大鼠海马组织
1.2.4 蛋白质免疫印迹（Western blot） 基因表达的变化

用含有 1% SDS、100 mmol/L Tris⁃HCl、1 mmol/L 为揭示 CH 在大鼠海马发育过程中的作用，分
PMSF的裂解液从神经元培养物或海马中提取蛋白 别在 P1、P7 和 P21 对 CH 组及对照组仔鼠海马组织
质。用BCA法测定每个标本的蛋白浓度，以保持相 进行转录组分析。在3个时间点进一步整合并鉴定
同的总蛋白量。蛋白提取液在 95 ℃热变性 5 min， 与 CH 神经活性、配体受体相互作用等重要生物学
在 10% SDS⁃PAGE 上电泳分离，转移到 PVDF 膜 过程相关的 9 个功能基因。与对照组相比，这些基
上。膜与 1∶1 000 TBST 稀释初级抗体于 4 ℃ 过夜， 因在海马组织中表现出动态变化，如热图和树状图
其次与对应的1∶1 000稀释二抗室温孵育2 h。膜清 所示（图1A）。为了阐明CH损伤对海马神经元生长
洗后，使用ECL化学发光液扫膜显色。 的影响机制，通过 IPA 构建了一个基因网络，确定
1.2.5 原代海马神经元的培养和siRNA转染 CAMK4是响应甲状腺激素减少的突出调节因子（图
取E17的SD胎鼠制备原代海马神经元，海马在 1）。数据表明，CAMK4 可能是介导 CH 子代海马异
HBSS 平衡盐溶液中解离，移至基础高糖培养基，在 常生长的潜在因子。
37 ℃下，0.125%胰蛋白酶消化20 min，然后加入2倍 2.2 CAMK4的表达情况
体积的含胎牛血清的高糖培养基停止消化，细胞于 通过Western blot进行CAMK4蛋白质水平验证
1 000 r/min离心4 min。去除上清液后，将细胞重悬 （图 2）。可以发现 CAMK4 的蛋白表达趋势与测序
于含血清培养基中，对于原代培养、解离的细胞被 结果一致，对照组大鼠中 CAMK4 表达呈时间依赖
接种在包被聚 D⁃赖氨酸的小圆玻片及 6 孔板内，细 性升高，P7时即可达到峰值，P7与P21的CAMK4表
胞密度为 1×10 个/cm ，37 ℃细胞培养箱培养 4 h 后 达无明显差异；而CH大鼠的CAMK4表达普遍低于
2
4
换含 B27 的 neurobasal 培养基。通过生产商的操作 对照组水平。基于上述蛋白水平验证的结果可以
指南对原代海马神经元进行 siRNA 转染，在 15 μL 发现，CAMK4 的表达水平在 CH 大鼠中均明显低于
的 20 μmol/L siRNA 储存液中加入 120 μL（1×）ribo⁃ 相应时间点对照组大鼠，提示CAMK4与TH 水平具
FECT TM CP 缓冲液，然后加入 12 μL riboFECT TM CP 有相关性，可能受TH调节。
试剂。在室温下轻轻混合并孵育15 min后，将转染 2.3 原代海马神经元siRNA敲降CAMK4的表达对
复合物加入培养于neurobasal培养基（终体积2 mL） 神经元树突的影响
的神经元中，siRNA 的最终浓度为 150 nmol/L，并在 在原代海马神经元中通过转染siRNA的方式敲
37 ℃细胞培养箱培养 24 h 后测定相应的 siRNA 转 降 CAMK4 的表达，进一步研究CAMK4对神经元树
染效率。 突的影响。首先，通过转染敲降了约50%的CAMK4
1.2.6 细胞免疫荧光 基因表达水平（图3A），继续培养原代海马神经元5 d
PBS 将培养原代海马神经元的小圆玻片清洗 后拍摄细胞荧光图观察神经元树突的形态变化（图
3 次，后于室温下 4%多聚甲醛中固定 30 min，后在 3C）。可以观察到敲降CAMK4基因表达后的神经元
PBS 中洗涤 3 次，5 min/次，于含 0.1%TritonX⁃100、 树突平均长度明显减小，显著低于正常海马神经元。
5%新生山羊血清和 5%马血清的 PBS 中 37 ℃水浴 2.4 T3对原代海马神经元培养的直接影响
锅封闭 1 h，将一抗在 PBS 中稀释后加在玻片上，在 在原代培养的CH海马神经元中加入T3能诱导