Page 20 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第8期
               ·1122 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年8月


              辟了新途径，在多种类型的肿瘤血脑屏障治疗中显                            10%胎牛血清和100 μg/mL青霉素/链霉素。所有细
              示出了良好的疗效。虽然cyclin/CDK复合物基因突                       胞置于含5% CO2培养箱，37 ℃培养。细胞培养液每
                       ［4］
              变很少见 ，但 cyclin D1      ［5- 6］ 在结直肠癌中常过表           2 d更换1次，常规PCR检测支原体。所有实验都采
              达 ，且 受 到 上 游 表 皮 生 长 因 子 受 体（epidermal            用对数生长期细胞进行。
              growth factor receptor，EGFR）、KRAS、PTEN 等基因             帕博西尼和厄洛替尼细胞用药以200 μmol/L和
              异常突变的影响导致细胞周期失调。进一步研究                             10 mmol/L 的浓度溶解于 DMSO 中，并在-80 ℃下储
              发现，帕博西尼（Palbociclib，商品名爱博新）作为首                    存。体内用药前现配现用，帕博西尼和厄洛替尼以
              个批准上市的CDK4/6抑制剂，可诱导细胞衰老 、凋                        2 mg/mL的浓度分别溶于pH=4的50 mmol/L L⁃乳酸
                                                       ［7］
                           ［9］
                                       ［10］
              亡 、增强放疗 和靶向治疗 的敏感性。由于研究                           钠溶液和6% Captisol溶液。
                ［8］
              有限，目前尚不清楚帕博西尼治疗结直肠癌是否有                            1.2.2 细胞活力测定
              效，因此，本研究的首要目标是评估帕博西尼在结直                                取状态良好并处于对数生长期的细胞，消化后
              肠癌模型中的有效性。                                        细胞计数，以每孔2 000个细胞的密度、100 μL的体

                  EGFR 作为致癌驱动因子，在 60%~80%的 CRC                  积接种于 96 孔板中。每个实验组设置 3~6 个重复
                                                      ［11］
              中过表达，为结直肠癌的治疗提供了重要靶点 。厄                           孔。细胞铺板24 h后使用完全培养基将药物储存液
              洛替尼（Erlotinib，商品名特罗凯）是一种有效的小                      梯度稀释成不同的工作浓度，每孔加入100 μL的含
              分子 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，已被批准用于晚期                         药培养基处理 3 d。每孔加入 10 μL Alamar blue 溶
              胰腺癌和非小细胞肺癌的治疗               ［12］ 。之前在 CRC 的       液，同时设置3~6个阴性对照。继续培养4 h后使用
              临床试验评估中显示毒性可耐受                ［13］ 。在食管鳞状         化学发光仪检测每孔的吸光度值，激发光波长为
              细胞癌中，厄洛替尼联合帕博西尼在体内表现出良                            534 nm，发射光波长为 584 nm。细胞相对增殖率=
              好的效果    ［14］ 。因此，本研究的第二个目标是评估帕                    （加药3 d实验组吸光度值-阴性对照吸光度值）/（未
              博西尼联合厄洛替尼治疗结直肠癌是否存在协同                             处理组吸光度值-阴性对照吸光度值）×100%。
              作用，并相互增强抗肿瘤活性。                                    1.2.3 克隆形成实验
                                                                     取对数生长期的细胞，以每孔 400~800 个细胞
              1  材料和方法
                                                                的密度、1 mL 的体积接种于 12 孔板中。细胞铺板
              1.1  材料                                           24 h 后加入 1 mL 的含药培养基，每 3 d 换药，直至
                  人结直肠癌细胞系HT29购自于中国科学院细                         对照组细胞密度达到 80%~90%。每孔加入 4%多
              胞库，p⁃EGFR、p⁃AKT、AKT、p⁃ERK1/2、p⁃MEK1/2、            聚甲醛固定 30 min，后加入吉姆萨染色液，避光染
              p ⁃ RB、RB、GSK3β、p ⁃ GSK3β、FoxM1、p ⁃ 4EBP1 和       色 60 min。染色结束后每孔用去离子水洗去残留
              GAPDH等抗体购自美国CST公司，帕博西尼和厄洛                         的染色液，晾干后拍照。图像使用Image J软件进行
              替尼（MCE 公司，上海），L⁃乳酸钠和 Captisol（阿拉                  细胞密度分析。
              丁，上海），DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青/链霉素                       1.2.4  细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）
              双抗和PBS缓冲液（Gibco公司，美国），细胞裂解液、                      测定
              BCA蛋白定量试剂盒、Alamar blue（上海翊圣生物），                        采用荧光探针 DCFH⁃DA 检测细胞内 ROS 水
              吉姆萨染色液（南京凯基生物），20，70⁃二氯荧光素二                       平。细胞铺板后用不同浓度药物处理 3 d，细胞经
              乙酸酯（DCFH⁃DA）活性氧荧光探针（北京索莱宝），                       PBS 清洗后，使用活性氧反应试剂盒检测细胞内

              20 只 4 周 龄 雌 性 SPF 级 NCG（NOD ⁃ Prkd⁃              ROS 累积水平，反应结束后，将细胞消化收集使用流
              cem26Il2rgem26/Gpt）购于江苏集萃药康生物科技公                  式细胞分析仪检测染色阳性的细胞发光值。氧化后
              司。结直肠癌组织通过江苏省肿瘤医院获得，来自于                           的激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。
              1 例因原发肿瘤而接受化疗后复发的患者，命名为                           1.2.5 细胞周期分布测定
              P328。动物实验全程将按照南京医科大学动物伦理                               采用 DNA 含量定量法测定细胞周期分布。细
              委员会批准的实验方案进行饲养和维护。                                胞铺板后第2天更换无血清培养基处理24 h进行周

              1.2  方法                                           期同步化，不同浓度的药物处理3 d后，将细胞消化
              1.2.1 细胞培养和药物配制                                   收集至离心管中，1 000 r/min 离心 3 min 去除上清
                  人结直肠癌细胞系HT29的培养基为DMEM 加                       液，用预冷的 PBS 清洗细胞后再次离心，将预冷的
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