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第41卷第8期        周小晖，贡叶清，刘晓蓉，等. 帕博西尼和厄洛替尼联合治疗结直肠癌的协同作用及其机制［J］.
                  2021年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（08）：1121-1127                      ·1123 ·


                75%酒精逐滴添加至离心管中，放置-20 ℃固定2 h后                     （图1B），结果显示帕博西尼呈现出剂量依赖性抗增
                将样品离心用1%牛血清白蛋白重悬于PBS中。将细                          殖和克隆形成抑制作用。
                胞用碘化丙啶（PI）和RNaseA以终浓度0.1 mg/mL，在                      为了探讨帕博西尼在短期增殖实验和长期克
                37 ℃下避光染色15 min后流式细胞仪检测。                          隆形成实验中发生药效的机制，检测了帕博西尼治
                1.2.6 蛋白免疫印迹实验                                    疗后对HT29细胞周期和胞内ROS累积的影响。基
                    总细胞蛋白通过标准流程提取和定量。细胞经                          于 CDK4/6 抑制剂的作用机制，帕博西尼能够诱导
                过PBS清洗后加入蛋白裂解液置于冰上裂解30 min，                       细胞发生G1期阻滞。低浓度（0.1 μmol/L）的药物处
                13 000 g 4 ℃离心15 min后收集上清。采用 BCA 试                理使得 HT29 细胞 G1 期阻滞将近 80%，随着浓度增

                剂盒测定蛋白浓度。取等浓度的蛋白样品经 SDS⁃                          加，阻滞率甚至高达 90%（图 1C、D）。同时发现，帕
                PAGE胶分离后转膜至PVDF膜上。用3%BSA室温                        博西尼处理导致 HT29 细胞内 ROS 水平显著提高，
                封闭 2 h，随后 4 ℃孵育一抗过夜。TBST 洗膜后室                     这表明活性氧在细胞内积累可能是帕博西尼发挥
                温孵育二抗2 h，TBST洗膜后，化学发光仪检测蛋白                        作用的重要原因（图1E、F）。
                表达情况。                                             2.2  帕博西尼联合厄洛替尼的协同抗肿瘤作用和

                1.2.7  结直肠癌患者来源的异种移植（PDX）模型的                      对多条致癌信号通路的抑制
                建立与药效实验                                               如图 2A 和 2B 所示，厄洛替尼的加入显著增强
                    4周龄雌性NCG小鼠在4%水合氯醛麻醉后，用                        了帕博西尼对HT29细胞的抗增殖活性。等效应图
                75%酒精消毒小鼠左侧腋下。做1个切口形成皮下                           和联合指数 CI 值计算结果表明两药组合之间的相
                口袋，将约3 mm 大小的患者肿瘤组织植入，用手术                         互作用为协同作用（CI 值＜1 表示协同作用，图
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                                                                                               ［15］
                缝线缝合切口。当肿瘤体积达到80~120 mm 时，将                       2C）。此外，使用Combenefit软件 生成的HSA协同
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                小鼠随机分为4组，每组5只。分别为对照组、帕博西                          矩阵显示，大部分两药组合的协同分数都在0以上，
                尼治疗组（25 mg/kg）、厄洛替尼治疗组（50 mg/kg）和                 表明帕博西尼和厄洛替尼存在协同作用（图2D）。
                联合治疗组。治疗方式为口服灌胃，每周 5 d，治疗                             同时，使用克隆形成实验来评估两药联合使用
                至少 4 周。小鼠每隔 1 d 称重 1 次，用游标卡尺测                     的长期效果。结果显示，两药联用后与单一药物治
                量肿瘤体积，肿瘤体积=长×宽 × 0.5。治疗期间监                        疗相比能够显著降低 HT29 细胞的克隆形成能力
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                测肿瘤生长情况，直到肿瘤达到 2 000 mm 的伦理                      （图2E、F）。这些结果表明，在结直肠癌中帕博西尼
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                范围最大体积后，对小鼠行安乐死并收集肿瘤组                             和厄洛替尼具有联合效应，是一种有潜力的治疗组
                织和器官。                                             合方式。
                1.3  统计学方法                                            为了解释两药联用的协同效应，通过免疫印迹
                    对于帕博西尼和厄洛替尼药物联用效应的评                           实验来揭示其作用机制。使用相对较低的浓度（帕
                价，使用 Compusyn 软件计算协同分数（combination                博西尼 20 nmol/L，厄洛替尼 2 μmol/L）处理 HT29 细
                index），使用 Combenefit 软件绘制量⁃效曲线并计算                 胞24 h后提取蛋白，通过蛋白免疫印迹实验检测多
                HAS分数。体外数据以均数±标准差（x ± s）表示，体                      条相关的关键信号通路是否发生改变。结果显示，
                内数据以均数±标准误（x ± sx ）表示。使用GraphPad                  两药联合后能够强有力地抑制多条关键信号通路
                Prism 8.0 对数据进行双尾 Student⁃t 检验或方差分                的活性。首先，相对于单药处理的细胞，两药联合
                析。实验中至少有 3 个重复孔，并在 2 个以上的独                        组显著抑制了总 RB、p⁃RB 和 FoxM1 水平；其次，有
                立实验中重复。P < 0.05为差异有统计学意义。                         效抑制了 EGFR 及其在 PI3K 和 RAS 信号通路中的
                                                                  下游分子 p⁃ERK、p⁃AKT、p⁃GSK3β和 p⁃4EBP1。两
                2  结 果
                                                                  药联用成功地减弱了 RB、PI3K 和 RAS 信号通路的
                2.1  帕博西尼抑制结直肠癌 HT29 细胞增殖、诱导                      强度，而这些信号通路的活性正是影响细胞增殖和
                HT29细胞周期阻滞和胞内ROS累积                                生长的重要通路，从而揭示二药联用产生协同效应
                    采用 Alamar blue 法检测的 0~2 μmol/L 的帕博            的原因（图2G）。
                西尼作用于结直肠癌细胞 HT29 后的增殖情况（图                         2.3  厄洛替尼增强了帕博西尼诱导的细胞周期阻
                1A）；通过克隆形成实验，检测 HT29 在 0.1、0.5 和                  滞和胞内ROS累积
                1.0 μmol/L的帕博西尼处理下细胞克隆形成的情况                           在HT29细胞中观察到帕博西尼和厄洛替尼显
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