Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 8

第42卷第1期
               · 2  ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年1月


                  血友病乙（hemophilia B）是一种由缺乏凝血因
                                                                1 材料和方法
              子Ⅸ（factor Ⅸ，FⅨ）而引起的 X 染色体隐性遗传
              性出血性疾病，是最常见的先天性出血性疾病之                             1.1  材料
                ［1］
              一 。血友病乙在男性中的发病率较高，每10万名                                35 d原代巴马猪胎儿成纤维细胞（PFF）由本组
                                                      ［2］
              男性中约有2.8例发生，无种族或地域差异性 。根                          实验室培养。DH5α感受态细胞、质粒小提试剂盒、
              据 FⅨ在患者体内的含量，血友病乙被分类为轻度                           质粒中提试剂盒（北京天根生化科技公司）；pX330
             （> 0.05~0.40 U/mL）、中度（0.01~0.05 U/mL）、重度           质粒（Addgene 423230）、BbsⅠ限制性内切酶、T4 Li⁃
             （< 0.01 U/mL）3 个等级    ［1，3］ 。FⅨ又称血浆凝血活             gase 连接酶（New England Biolabs 公司，美国）；Basic
              酶，是一种维生素 K 依赖性血浆蛋白酶，由肝脏合                          Nucleofector TM  Kits 和 细 胞 电 转 仪（Lonza 公 司 ，德
              成，正常情况下在血浆中以无活性的酶原形式存                             国）；DMEM 培养液，胎牛血清、胰酶、青链霉素双抗

              在。人体内 FⅪa（activated factor Ⅺ，FⅪa）及 FⅦa            和PBS 缓冲液（Gibco 公司，美国）；引物序列和磷酸
             （activated factor Ⅶ，FⅦa）通过连续切割 FⅨ的 p.              化的寡核苷酸序列由南京金斯瑞公司合成。
              Arg191⁃Ala192和p.Arg226⁃Val227位点，从而使FⅨ             1.2  方法
              活化。随后，FⅨa（activated factor Ⅸ，FⅨa）与 FⅧa            1.2.1  人/猪F9基因同源性分析
             （activated factor Ⅷ，FⅧa）形成 FⅩ（factor Ⅹ，FⅩ）              在 NCBI 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）

              酶复合物，切割 FⅩ的 p.Arg182⁃Ser183 和 p.Arg234⁃           中检索包括人和猪在内的多个物种的F9基因序列，
              Ile235位点，使FⅩ活化，参与体内凝血级联反应 。                       利用 MEGA X 软件和在线工具 iTOL（https：//itol.em⁃
                                                         ［4］
              编码 FⅨ的基因 F9 位于 Xq27.1，全长约 34 kb，由 8               bl.de/）绘制系统进化树。此外，搜索FⅨ的氨基酸序
              个外显子和 7 个内含子构成，该基因的突变或缺失                          列，利用 ClustalX2 软件进行人和猪 FⅨ氨基酸序列
                                      ［5］
              是血友病乙发病的根本原因 。截至2020年2月，FⅨ                        的比对，再用 DNAman 软件计算两者氨基酸序列的
              变异体数据库（http：//www.factorix.org/）已统计血友             相似值。
              病乙患者F9基因突变形式有1 244种，包括点突变、                        1.2.2  人/猪FⅨ蛋白的结构比较
              插入、缺失等，分布于内含子、外显子和非编码区                                 利用 DNAstar软件中的protein模块分析人和猪
              域，但最常见的突变发生在蛋白编码区，且以点突                            FⅨ蛋白的二级结构，使用Chou⁃Fasman算法预测人
              变为主   ［5⁃7］ 。                                     和猪 FⅨ蛋白α螺旋、β折叠、β转角的比例。使用
                  血友病乙作为一种基因病，针对其遗传发病                           Swiss Model 在 线 工 具（https：//www.swissmodel.ex⁃
              机制、基因诊断、基因治疗的研究是当前血友病乙                            pasy.org/）对人和猪 FⅨ蛋白进行三维建模，然后利
              研究的重点，但是这些研究需要有良好的动物模                             用 pymol 软件比较两者三维结构的相似度，得出均
              型。目前经典的血友病动物模型有狗和小鼠，但两                            方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值。
              者与人类亲缘关系远、生理特性不同，不能精准地                            1.2.3  sgRNA的设计
              模拟人类血友病的生理特性和临床表征                    ［8-9］ 。猪是         依据 NCBI 数据库中猪的 F9 基因序列，利用在
              除灵长动物以外与人类在进化上亲缘关系最近的                             线工具 Primer3 web（http：//primer3.ut.ee/）设计包含
              物种之一，在遗传、生理生化和疾病发展等方面与                            第 2 外显子在内的 1 kb 左右基因序列的 PCR 引物
              人类具有极高的相似性，尤其是凝血系统与人类                             exon⁃2，上游：5′⁃ACCAAAGCTGCTCTCCTGACTCA⁃
              十分相似，因此是本次血友病乙动物模型构建的                             3′，下游：5′⁃TGCTGGCGTAAACCTAGAGT⁃3′，使用
              良好选择    ［10］ 。                                    巴马猪PFF的基因组DNA作为模板进行扩增，反应
                  本研究首先通过分析人和猪F9基因的同源性，                         体系：50 μL，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，
              以及对人和猪FⅨ二级结构及三级结构的模拟和分                            56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min；保存于
              析，验证了人和猪 FⅨ的高度同源性。其次以巴马                           4 ℃。通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物长度，并
              小型猪胎儿原代成纤维细胞（porcine fetal fibroblast，            送南京擎科公司进行测序，以确认巴马猪F9基因第
              PFF）为原材料，结合 CRISPR/Cas9 技术，构建 F9 基                2外显子序列与数据库记载的符合程度。将测序获
              因第 2 外显子突变的单克隆细胞系，为进一步利用                          得的巴马猪 F9 基因第 2 外显子序列作为模板，利
              体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）        用 CRISPR 在线靶点设计工具（http：//www.e⁃crisp.
              技术构建血友病乙猪模型提供了原材料。                                org/E⁃CRISP/designcrispr.html）设计 2 对 25 bp 左右
   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13