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第42卷第1期       朱晓晗，刘晓蕊，李       琳，等. 利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系［J］.
                  2022年1月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：001-007                       · 3  ·


                的 sgRNA 寡核苷酸序列，分别命名为 2⁃sgRNA1、                    记。去除皿中培养液，DPBS 清洗，在标记处放置合
                2⁃sgRNA2，5′末端磷酸化修饰，交由南京金斯瑞公                       适大小的克隆环，用 0.25%的胰酶消化约 2 min，加
                司合成（表1）。                                          入无药培养液中止消化，转移细胞悬液至 24 孔板，
                     表1 F9基因靶向位点及sgRNA寡核苷酸序列                      孔板盖上标记克隆编号和日期。24 孔板中的细胞
                Table 1 F9 gene targeting loci and sgRNA oligonucleotide  隔日用含 G418 的培养液进行换液，直至细胞长满
                        sequence                                  皿底，胰酶消化并传代至 12 孔板（遗留部分细胞在
                     名称                  序列（5′→3′）                原皿），待 12 孔板中的细胞长满后，即可冻存备用；

                   2⁃sgRNA1 F    CACCGAGGTATAATTCAGGCAAAC         遗留在 24 孔板中的细胞，加入培养液继续培养，长
                   2⁃sgRNA1 R    AAACGTTTGCCTGAATTATACCTC         满皿底后提取基因组 DNA，用于鉴定单细胞克隆
                   2⁃sgRNA2 F    CACCGCTCCGCATGTGAAGGATGTT              ［12］
                                                                  基因型      。
                   2⁃sgRNA2 R   AAACAACATCCTTCACATGCGGAGC
                                                                      单细胞克隆基因型的鉴定：用 0.25%的胰蛋白
                1.2.4  CRISPR/Cas9打靶载体的构建                         酶消化24孔板里的细胞，用NP40裂解液裂解细胞，
                    CRISPR/Cas9 打靶载体构建主要包括：引物退                    提取基因组 DNA，用引物 exon⁃2 进行 PCR，反应体
                火、pX330载体酶切、线性化pX330载体与sgRNA连                     系 50 μL，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃

                接等步骤。首先，用高压灭菌的去离子水分别将 2                           30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 7 min；保存于
                对寡核苷酸单链稀释成 100 μmol/L 浓度，然后从正                     4 ℃。通过琼脂糖凝胶电泳观察 PCR 产物长度，并
                链引物与负链引物中各吸取1 μL，加入8 μL去离子                        将 PCR 产物送南京擎科公司进行测序。测序结果
                水中。将混合好的 10 μL 体系，在 PCR 仪中进行退                     返回后与野生型序列进行对比，得出每个单细胞克
                火操作：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min；结束后以每分钟                隆的基因型；根据结果去除 12 孔板中的阴性号，保
                降 5 ℃的速度降至25 ℃保持。同时，按照说明书步                        留阳性号，并进行冻存。
                骤，将 pX330 载体用 BbsⅠ酶进行酶切使其线性化，
                                                                  2 结    果
                再分别将线性化的pX330载体与退火的双链sgRNA
                用 T4 Ligase 连接酶进行连接。将连接产物转化至                      2.1  人/猪F9基因同源性分析
                大肠杆菌 DH5α中，涂板后挑取单菌落进行菌株保                              利用MEGA X软件和在线工具iTOL绘制系统发
                存和测序，根据返回的测序结果筛选包含正确打靶                            育树，结果表明人和猪F9基因遗传距离较近（图1）；
                载体的菌株，将对应菌株扩大培养后利用无内毒素                            利用ClustalX2软件对人与猪FⅨ的氨基酸序列进行
                质粒中提试剂盒进行质粒提取。                                    比对，结果显示两者 FⅨ氨基酸序列高度一致（图
                1.2.5  细胞培养                                       2）；接着用 DNAman 软件计算人与猪 FⅨ氨基酸序
                    原代巴马猪 PFF 用 16% FBS 培养约 24 h，条件               列的相似值，结果为83.33%。以上结果表明人和猪
                为37 ℃，5% CO2。接着用DPBS清洗贴壁细胞，然后                     FⅨ氨基酸序列具有很高的同源性。
                使用0.05%胰酶消化约2 min，终止消化后将细胞悬                       2.2  人/猪FⅨ结构的比较
                液收集到15 mL 离心管，1 200 r/min 离心5 min 得到                  利用 DNAstar软件中的protein模块分析人和猪
                细胞沉淀。按照Lonza成纤维细胞转染试剂盒的说                          FⅨ的二级结构，并使用 Chou⁃Fasman 算法预测人
                明书配制核转液，在核转液中加入适量打靶载体及                            和猪FⅨ的α螺旋、β折叠、β转角比例，结果显示，人

                抗性质粒（pHY54 SV40⁃neo），用核转染程序 U 023                 的 FⅨα螺旋占 26.9%，β折叠占 35.8%，β转角占
                转染。转染结束后用 2~3 mL 16% FBS 培养液重悬                    33.8%（图 3A）；猪的 FⅨα螺旋占 21.2%，β折叠占
                细胞并分盘至 20 个 10 cm 培养皿中，使每个视野下                     32.9%，β转角占35.5%（图3B）。由此可见，人和猪FⅨ
                的细胞数在 50 个左右。细胞培养皿在恒温培养箱                          具有相似的二级结构。使用 Swiss Model 在线工具
                                         ［11］ 。                   对人和猪FⅨ进行三维建模，接着利用pymol软件比
                中培养，条件为37 ℃，5% CO2
                1.2.6  单细胞克隆的筛选与鉴定                                较两者三维结构的相似度，得出 RMSD 值为 0.149，
                    细胞筛选：细胞培养24 h 后，用含有 G418 药物                   表明两者在三维结构上亦具有极高的相似性（图
                的培养液进行换液。药物筛选第 9 天左右，在 4 倍                        3C）。以上结果表明，人/猪 FⅨ具有高度一致的同
                镜下观察到单细胞克隆，挑选状态佳的单细胞克                             源性，因此可以推测人/猪FⅨ在对应的组织内具有
                隆，显微镜下观察其位置，并于培养皿的皿底做标                            相似的生理功能。
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