Page 11 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期 朱晓晗，刘晓蕊，李 琳，等. 利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系［J］.
2022年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：001-007 · 5 ·

A Scale C
50 100 150 200 250 300 350 400 450
A Alpha，Regions⁃Garnier⁃Robson
A Alpha，Regions⁃Chou⁃Fasman
B Beta，Regions⁃Garnier⁃Robson
B Beta，Regions⁃Chou⁃Fasman
T Turn，Regions⁃Garnier⁃Robson
T Turn，Regions⁃Chou⁃Fasman
50 100 150 200 250 300 350 400 450
人
B Scale
50 100 150 200 250 300 350 400 450
A Alpha，Regions⁃Garnier⁃Robson
A Alpha，Regions⁃Chou⁃Fasman
B Beta，Regions⁃Garnier⁃Robson
B Beta，Regions⁃Chou⁃Fasman
T Turn，Regions⁃Garnier⁃Robson
T Turn，Regions⁃Chou⁃Fasman
50 100 150 200 250 300 350 400 450
猪
A、B：人/猪FⅨ二级结构分析，红色表示α螺旋，绿色表示β折叠，蓝色表示β转角；C：人/猪FⅨ三级结构比较，红色为人FⅨ三维建模图，绿
色为猪FⅨ三维建模图；RMSD=0.149。
图3 人/猪FⅨ蛋白质二级结构和三级结构分析
Figure 3 Analysis of FⅨ protein secondary and three⁃dimensional structures between human and pig

A sgRNA1 C AC G A A A C A C C G A G G T AT A A T T C A G G C A A A C G T T T T A G A G C
gaggtataattcaggcaaactgg
sgRNA2
ctccgcatgtgaaggatgttagg
F9 1kb
start
▲
sgRNA1
B D A G A A AC A C C G C T C C G C A T G T G A A G C AT G T T G T T T T A G A G C
U6 CBh NLS hSpCas9 NLS bGHpA
pX330：

BbsI BbsI
5`⁃ aggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctag
sgRNA2
3`⁃ tcctgctttgtggcccagaagctcttctggacaaaatctcgatc
guide sequence insertion site
A: 巴马猪F9基因靶点示意图，红色区域为2号外显子；箭头所指的灰色序列为靶序列，绿色序列为Cas9识别的PAM序列；B：pX330载体
示意；C、D：重组载体示意图，黑色划线处为插入序列。
图4 F9基因靶点和重组载体测序
Figure 4 Targets of F9 gene and sequencing of recombinant vectors

创伤后出血不止，以及长期反复出血导致的关节畸 年代，美国 Chapel Hill 鉴定出患有血友病乙的狗，
形和躯体残疾等。中国血友病患病率为 3.6/10 万， 其发病机制及临床病理表现与人类血友病乙极为
［13］ ［16］
其中，血友病乙所占比例为16.13% 。由于中国人 相似。二十世纪末，Monahan 等 提出将其用于血
口基数大，新增人口多，血友病乙仍是影响众多家 友病治疗的临床前动物试验。基因工程技术推动
庭的遗传疾病之一。目前血友病的治疗方式包括 了血友病乙动物模型的研究和应用。1997 年，Lin
输注凝血因子制品、药物辅助治疗及正处于探索阶 等 ［17］ 利用胚胎干细胞基因打靶的方式获得第一例
段的基因治疗术。疾病动物模型是研究血友病致 血友病乙小鼠模型。二十一世纪以来，基因编辑技
病机制和治疗策略的重要工具。因此，建立一个与 术飞速发展，基于 DNA 双链断裂（double⁃strand
人类血友病乙生物特性和临床表征相近的动物模 break，DSB）激活细胞内部修复机制的工程化核酸
型显得尤为重要 ［14-15］ 。 酶基因编辑技术逐渐成为基因编辑技术的主流。
第1例血友病乙动物模型形成于二十世纪八十 2013年，Cong等 ［18］ 利用规律成簇的间隔短回文重复