Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第1期
· 10 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月
PMSF 和蛋白酶抑制剂（100 μL+1 μL+1 μL），使用 2.2 RREB1⁃siRNA对肾小球系膜细胞增殖的影响
细胞刮刮下细胞并于冰上裂解 1 h，集于 EP 管中， CCK⁃8 法检测细胞增殖活力变化，结果显示：
4 ℃ 12 000 r/min离心30 min后取上清，BCA法检测 TGF⁃β1组系膜细胞增殖活力明显高于空白对照组，
蛋白浓度，稀释至最小浓度，并加入1/4 体积5×上样 差异有统计学意义（P < 0.01）；与 TGF⁃β1 组相比，
缓冲液，100 ℃金属加热器中变性 5 min。用 SDS⁃ TGF⁃β1+RREB1⁃siRNA 组细胞增殖活力下降，差异
PAGE电泳的方法分离蛋白质，电泳后将蛋白转移至 有统计学意义（P < 0.01，图2）。
PVDF膜上，室温下5% BSA封闭 1 h，加一抗（稀释比
例1∶1 000）于室温孵育30 min，再4 ℃孵育过夜。次 4
*
日室温下复温30 min后用1×TBST洗膜3次后，加二 3 #
抗（1∶2 000），室温孵育 1 h。1×TBST洗膜3次，加显
影液后用天能凝胶成像系统进行图像的扫描及记录。 相对细胞活性 2
1.2.6 流式细胞术检测细胞周期 1
收集各组细胞，加入 75%冰乙醇，吹打均匀， 0
RREB1⁃siRNA组
-20 ℃ 固定过夜，上机前再次离心，加 1 mL 冰浴预 NC组
冷的PBS重悬细胞，配制碘化丙啶染色液，每管加入 空白对照组 TGF⁃β1组 TGF⁃β1+NC组
500 μL 碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉 TGF⁃β1+RREB1⁃siRNA组
淀，室温下避光孵育30 min后流式细胞仪检测细胞
周期。
与空白对照组相比，P < 0.01；与TGF⁃β1组相比，P < 0.01（n=3）。
#
*
1.3 统计学方法
图 2 RREB1⁃siRNA 干扰对 TGF⁃β1 诱导的系膜细胞增殖
采用 Graph Pad Prism4 统计学软件进行数据分
的影响
析，计量资料以均数±标准差（x ± s）表示，组间差异 Figure 2 Effects of RREB1⁃siRNA interference on TGF⁃
比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），两两 β1⁃mediated mesangial cell proliferation
比较采用SNK检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2.3 RREB1⁃siRNA 对肾小球系膜细胞增殖相关基
2 结 果
因表达的影响
2.1 TGF⁃β1对肾小球系膜细胞α⁃SMA及RREB1表 与对照组比较，TGF⁃β1组α⁃SMA、PCNA等增殖
达的影响 相关基因mRNA 表达量明显增加，差异有统计学意
与空白对照组相比，TGF⁃β1 组系膜细胞α⁃ 义（P < 0.01，图3A、B）；与TGF⁃β1组比较，TGF⁃β1+
SMA、RREB1 蛋白表达显著增加，差异有统计学意 RREB1⁃siRNA 组α⁃SMA、PCNA 等增殖相关基因
义（P < 0.01，图1）。 mRNA 的表达量显著下降，差异有统计学意义（P <
0.01）。与对照组比较，TGF⁃β1 组 RREB1 mRNA 表
空白对照组 TGF⁃β1组
达量增加；与 TGF⁃β1 组比较，TGF⁃β1+RREB1⁃siR⁃
α⁃SMA 45 kDa
NA 组 RREB1 mRNA 表达量下降，差异有统计学意
义（P < 0.01，图3C）。
RREB1 210 kDa
2.4 RREB1⁃siRNA 对肾小球系膜细胞增殖相关蛋
GAPDH 37 kDa
白表达的影响
1.5 * 空白对照组 与空白对照组相比，TGF⁃β1 组α⁃SMA、PCNA、
蛋白相对表达量 1.0 * RREB1 蛋白的表达明显升高（P < 0.01）；与 TGF⁃β1
TGF⁃β1
0.5
RREB1蛋白的表达量明显下降，差异有统计学意义
0 组比较，TGF⁃β1+RREB1⁃siRNA 组α⁃SMA、PCNA、
α⁃SMA RREB1
（P < 0.01，图4）。
与空白对照组相比，P < 0.01（n=3）。
*
图1 TGF⁃β1对系膜细胞α⁃SMA及RREB1表达影响 2.5 RREB1⁃siRNA对肾小球系膜细胞周期的影响
Figure 1 Expression of α⁃SMA and RREB1 protein levels 与对照组比较，TGF⁃β1 组 G1 期细胞百分率明
in TGF⁃β1⁃mediated mesangial cell 显降低，G2、S 期细胞百分率明显升高，差异有统计
