Page 21 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 21

第42卷第1期 刘       苏，徐巍龙，查 敏，等. miR⁃296⁃5p在糖尿病肾病db/db小鼠血浆外泌体中的表达及功能［J］.
                  2022年1月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：014-022                        · 15  ·


                    肾间质纤维化是糖尿病肾病（diabetic nephropa⁃               10周龄db/m小鼠为对照组，在南京医科大学实验动
                thy，DN）进展至终末期肾病的主要病理途径，转录                         物中心适应性喂养 2 周，麻醉后对小鼠行眼眶采血
                因子Snail1介导的肾小管上皮细胞⁃间充质转化（ep⁃                      致死，血浆混样后行外泌体 RNA 测序及生化检测。
                ithelial⁃mesenchymal transition，EMT）通过旁分泌等        完成差异 miRNA 筛选后，再次选取 6 只 10 周龄 db/
                作用，促进肌成纤维细胞的募集或增殖，是加速肾                            db 小鼠为模型组，6 只 10 周龄 db/m 小鼠为对照组，
                                         ［1］
                间质纤维化的重要环节之一 。Snail1 受到多种微                        重复上述饲养及处死流程，血浆混样后行外泌体鉴
                                             ［2］
                小核糖核酸（miRNA，miR）的调控 ，血浆/血清外泌                      定及外泌体 miRNA 验证。24 h 尿液标本利用代谢
                体包裹的 miRNA 具有高稳定性、源细胞特征及靶                         笼收集。肾组织标本部分冻存于液氮中，用于RNA
                        ［3］
                向功能性 ，是体内各组织/器官间细胞通讯的新                            和蛋白提取；部分保存于多聚甲醛，包埋后用于
                    ［4］
                途径 ，血浆外泌体 miR⁃296⁃5p 与肿瘤细胞的 EMT                   Masson 染色及免疫组化。动物实验按照南京医科
                相关 ，目前尚无miR⁃296⁃5p在DN血浆外泌体中表                      大学实验动物福利伦理委员会规定进行操作，伦理
                    ［5］
                达及对肾小管上皮细胞 EMT 影响的相关研究，因                          批件编号：IACUC⁃2103058。
                此，本研究拟通过DN小鼠模型，利用外泌体RNA测                          1.2.2  小鼠生化指标检测
                序及生物信息学分析等手段，明确 miR⁃296⁃5p 在                          血、尿标本送南京润太医学检验有限公司实验
                DN 小鼠血浆外泌体中的表达变化，并进一步探索                           室，测定血尿素（BUN）、血肌酐（Scr）、血胱抑素 C
                其参与糖尿病肾病EMT进程的可能机制。                              （Cys⁃C）、空腹血糖（FBG）、24 h尿蛋白定量（Upro）。
                                                                  1.2.3  小鼠血浆外泌体miRNA测序
                1 材料和方法
                                                                      分别取2 mL db/m 组和db/db 组小鼠血浆，送上
                1.1  材料                                           海其明生物技术有限公司进行血浆外泌体 miRNA
                    动物：10周龄SPF级健康雄性db/db小鼠12只，                    测序，并利用生物信息学软件进行分析。按|log2 FC|
                雄性db/m小鼠12只，体重20~45 g，由南京大学实验                     值由高到低进行验证。
                动物中心提供［动物许可证号：SCXK（苏）：2018⁃                       1.2.4  血浆外泌体提取
                0008］。                                                分别取2 mL db/m 组和db/db 组小鼠血浆，采用
                    主要试剂：exoRNeasy Midi Kit（Qiagen 公司，美           差速超速离心法，予 300 g，4 ℃离心 10 min；取上清
                国）；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem⁃   液，2 000 g 4 ℃离心10 min，12 000 g 4 ℃离心30 min；
                loop）、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（南      120 000 g 4 ℃离心70 min，取透明沉淀重悬于PBS，
                京诺唯赞生物）；Snail1 野生型双荧光素酶报告质                        所得即为外泌体溶液；取其中20 μL，加入PBS后再
                粒、Snail1突变型双荧光素酶报告质粒（安徽通用生                        次 120 000 g 4 ℃离心 70 min，取透明沉淀重悬于
                物）；miR⁃296 mimics、NC（苏州吉玛基因）；293T 细               PBS，所得即为电镜使用。
                胞（ATCC，美国）；Lipofectamine 2000（Invitrogen 公        1.2.5  透 视 电 子 显 微 镜 及 纳 米 颗 粒 跟 踪 分 析
                                            TM
                司，美国）；DMEM 高糖、FBS（Hyclone 公司，美国）；                （nanoparticle tracking analyze，NTA）鉴定外泌体
                青链双抗（上海生工生物）；双荧光检测试剂盒（Pro⁃                            外泌体样本静置于铜网上 1 min，2%醋酸双氧
                mega公司，美国）；苏木素⁃伊红染液试剂盒（南京凯                        铀染色液室温染色1 min，将染色完成的样本放于灯
                基生物）。                                             下烤10 min，透射电镜观察拍照，保存图片。外泌体
                    主要仪器：荧光定量PCR仪（ABI7300）、细胞培养                   样本以 1×PBS buffer 稀释，使用 ZetaView PMX110
                箱（Thermo）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS，IX71）、超                 进行 NTA，结合 Stockes⁃Einstein 方程式计算外泌体
                净工作台（苏州安泰科技有限公司）、低温冷冻离心机                          粒径和浓度。
               （Sigma 3K15）、脱色摇床（海门市其林贝尔TS200A）、                  1.2.6  小鼠血浆外泌体RNA提取
                发光检测仪（Molecular Devices SpectraMax i3）、超速             使用 QIAGEN exoRNeasy Midi Kit 试剂盒直接
                                                     ®
                离心机（Himac CP80WX）、透视电子显微镜（Tec⁃                    提取血浆外泌体RNA，步骤为：加等体积Buffer XBP
                nai）、ZetaView Particle Metrix（Particle Metrix）。   到样品中，500 g离心1 min；5 000 g离心1 min，将离
                1.2  方法                                           心柱转移到新的收集管中，加 700 μL QIAzol 到膜
                1.2.1  分组及取样                                      上，5 000 g离心5 min，收集裂解液，室温孵育5 min；
                    首先选取6只10周龄db/db小鼠为模型组，6只                      加入 90 μL 氯仿，震荡 15 s，室温孵育 2~3 min，4 ℃
   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26