Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期
· 16 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月

12 000 g 离心 15 min；转移上层水相到新的离心管 置1 min，全速离心1 min，获得的RNA放-80 ℃冰箱
中，加入2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀；转移混合样 备用，行血浆外泌体miRNA验证。
品到离心柱中，放入2 mL收集管中，室温，> 8 000 g 1.2.7 实时定量qPCR（RT⁃qPCR）检测
离心15 s；加700 μL Buffer RWT到离心柱中，>8 000 g 外泌体 RNA 提取、逆转录及荧光定量 PCR 反
离心15 s；加500 μL Buffer RPE到离心柱中，>8 000 g 应体系及程序参照试剂说明书，miR⁃296⁃5p 和
离心15 s，重复这一步骤；将离心柱转移到新的收集 Snail1 mRNA 的表达情况用 2 - ΔΔCt 方法进行相对定
管中，开盖全速离心5 min使膜晾干；将离心柱放入 量分析，分别以 U6 和 GAPDH 为内参，引物序列见
新的1.5 mL离心管中，加14 μL水到膜中央，室温放 表1。

表1 用于RT⁃qPCR的引物序列
Table 1 Primer sequences for RT⁃qPCR

名 称 引物 序列（5′→3′）
U6 正向 CGCTTCGGCAGCACATATAC
反向 AAATATGGAACGCTTCACGA
正向 ATGGGTGTGAACCACGAGA
Mus GAPDH
反向 CAGGGATGATGTTCTGGGCA
正向 GAGGGCCCCCCCTCAA
mmu⁃miR⁃296⁃5p
反向 AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
茎环引物 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGA
正向 CGCGTGGCAGTGTCTTAGCT
mmu⁃miR⁃34a
反向 AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
茎环引物 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC
正向 GAGGACAGTGGCAAAAGCTC
Mus snail1
反向 AAGATCTTCCGCGACTGGG
正向 CTCTGTCTGGATCGGTGGCTC
Mus α⁃SMA 反向 GCTTCGTCGTATTCCTGTTTGC
正向 ACTTTGGTGTGGGTCAGGAA
Mus E⁃cadherin 反向 CACATGCTCAGCGTCTTCTC

1.2.8 生物信息学分析 位点突变后的基因序列）。
利用TargetScan、miRanda软件，预测靶向Snail1 1.2.9 双荧光素酶实验
的miRNA，取两种软件预测结果的并集。mmu⁃miR⁃ 构建野生型和突变型的 Snail1⁃UTR 双荧光报
296⁃5p成熟体序列来自miRBase 数据库。利用Tar⁃ 告质粒（Snail1⁃WT，Snail1⁃MUT）。将对数生长期的
getScan 软件预测 mmu⁃miR⁃296⁃5p 与 Snail1 的结合 293T 细胞以 1×10 个/mL 接种至 24 孔培养板，每孔
5
位点，根据结合位点碱基序列设计突变型载体序 500 μL。将 Snail1⁃WT、Snail1⁃MUT 与 miR⁃296⁃5p
TM
列 ，突 变 序 列 为 ：5′ ⁃ ACATGTCCAGGTGCCCCT⁃ mimics 和 mimics NC 按照 Lipofectamine 2000 说明
GGGCCTGGGCAACTGTTTCAGCCCCCGCCCCCAT ⁃ 书步骤转染至 293T 细胞，每组实验设置 3 个重复。
TTGTCCTGGTGACACCTGTTTCACAGCAGTTTAAC⁃ 培养箱内培养48 h后，参照双荧光素酶报告基因检
TGTCTCAGAAGGGACCATGAATAATGGCCATCAC ⁃ 测试剂盒步骤检测荧光素酶活性。
TTGTTAGGGGCCAAGTGGGGTGCTTCAGCCTGGC ⁃ 1.2.10 小鼠肾组织病理学检查
CAATGTGTCTCCCAGAACTATTTTCCCCGGGTAC ⁃ 肾组织用 4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二
AGGTGGCCCCGGGAGAAAGATGTTTACATTTTAA ⁃ 甲苯透明，浸蜡包埋，4 μm 切片，Masson、HE染色后
AGGTATTTATATTGTAAGCAGCATTTTGTATAGTT ⁃ 光镜下观察肾组织病理学变化。免疫组化分析小
AATATGTACAGT T T ATTGATATTCAATAAAATGG⁃ 鼠肾组织E⁃cadherin、α⁃SMA及Snail1蛋白表达。定
TTAATTTATATACTAAAAA⁃3′（下划线部分为结合 量方法为将每个指标 db/m 组小鼠的染色面积作为