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第42卷第1期              赵雅洁，施会敏，何田田，等. RREB1对TGF⁃β1诱导系膜细胞增殖的影响［J］.
                  2022年1月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：008-013                       · 9  ·


                    过敏性紫癜（Henoch⁃Schonlein purpura，HSP）是          细胞，按实验分组如下：①空白对照组；②RREB1⁃
                儿科常见的风湿免疫性疾病，主要发生机制目前认                            siRNA 组；③NC 组（阴性对照 siRNA）；④TGF⁃β1 组
                为是IgA介导的全身性小血管炎，临床表现多样。紫                         （10 ng/mL）；⑤TGF⁃β1+RREB1⁃siRNA组；⑥TGF⁃β1+
                癜 性 肾 炎（Henoch ⁃ Schonlein purpura nephritis，     NC组。
                HSPN）是过敏性紫癜常见的脏器损害之一，肾脏损                          1.2.2  细胞转染
                                               ［1］
                伤和HSP患儿的远期预后密切相关 。肾小球系膜                               收集对数生长期MC细胞，用培养液稀释细胞，
                                                     ［2］
                增生性病变是HSPN 主要的病理表现之一 。转化                          然后将细胞接种于6孔板中，培养至基本融合为一
                生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）是       层，按照Lipofectamine 2000说明书进行转染。先用
                一种多功能细胞因子，目前多用于系膜细胞增殖的                            无血清培养液稀释脂质体、RREB1⁃siRNA和阴性对

                体外模型制备。ras反应元件结合蛋白1（ras respon⁃                   照，之后取等体积脂质体和RREB1⁃siRNA或阴性对
                sive element binding protein 1，RREB1）是我们采用多       照轻柔混合，室温孵育20 min后加入到培养好的细
                肽芯片技术筛选获得，在 HSPN 患儿病初血清中差                         胞中，混匀后置培养箱中培养，6 h 后更换为完全培
                异表达增多的一条多肽对应的前体蛋白，与肾小球                            养基，转染24 ｈ后收集细胞进行验证。
                滤过率相关，广泛参与了细胞生长和增殖、转录调                            1.2.3  CCK⁃8法检测细胞增殖活力
                控和 DNA 损伤修复过程 。本课题拟在体外观察                              收集MC细胞，用培养液稀释细胞，然后将细胞
                                      ［3］
                RREB1表达变化对TGF⁃β1诱导的系膜细胞增殖的                        按比例接种于 96 孔板中，每孔加入 100 μL 细胞悬
                影响，探讨 RREB1 在系膜细胞增殖中的作用，进一                        液，按照实验安排分组预培养细胞后向每孔分别加
                步探讨HSPN的可能发生机制，为HSPN的诊治提供                         入 10 μL CCK⁃8 溶液，在 37 ℃培养箱中培育 1~4 h，
                新的靶点。                                             用酶标仪测量细胞在 450 nm 处的吸光度值。每组
                                                                  设 4 个复孔，设置空白调零孔（只加 DMEM 溶液和
                1 材料和方法
                                                                  CCK⁃8溶液），以上实验重复3次。
                1.1  材料                                           1.2.4  RT⁃PCR技术检测目的基因mRNA的表达
                    大鼠系膜细胞（mesangial cell，MC）购自中国典                    细胞按组种板干预 24 h 后，将 1 mL TRIzol 试
                型培养物保藏中心。胎牛血清、胰酶、DMEM培养基                          剂加入 6 孔板内，提取细胞总 RNA，20 μL DEPC 水
               （Gibco 公司，美国），TGF⁃β1（R＆D 公司，美国），                   溶解，用 Nanodrop 分光光度计检测浓度，根据逆转
                TRIzol 试剂（Thermo Fisher 公司，美国），PCR 检测试            录试剂盒说明书操作制备 cDNA，取适量产物配制
                剂盒（TaKaRa公司，日本），PCR引物由上海锐真生物                      10 μL PCR 反应体系，用 ABR7600 实时荧光定量
                公司合成，BCA试剂盒（南京凯基生物公司），鼠抗人                         PCR仪进行检测。GAPDH为内参，检测α⁃SMA、PC⁃
                GAPDH多克隆抗体购于（上海Abway公司），α⁃SMA                     NA 及 RREB1 mRNA 表达。以 2       -ΔΔCT  法计算相对表
                抗体（常州 Affinity 公司），PCNA、RREB1 抗体（Santa            达量。所用引物序列见表1。
                Cruz 公司，美国），PVDF 膜和显影液（Milipore 公司，
                                                                                 表1   PCR引物序列
                美国），HRP标记的山羊抗兔二抗（Proteintech公司，
                                                                           Table 1  Sequences of PCR primers
                美国），CCK⁃8试剂盒（Cell Counting Kit⁃8，同仁公司，
                                                                     名称          引物序列（5’→3’）         产物长度（bp）
                日本），细胞周期检测试剂盒（Everbright公司，美国）。
                                                                   RREB1⁃F  CGGCAGCTCTGTAACACGTC         61
                1.2  方法                                            RREB1⁃R TCCCCCTCTCACCCTGATAA          58
                1.2.1  细胞培养                                        PCNA⁃F   GACTTAGACGTTGAGCAACTTG       57
                    将MC细胞株用含10% 胎牛血清的DMEM培养                        PCNA⁃R   ATACGTGCAAATTCACCAGATG       57
                基（含青霉素100 μL /mL，链霉素100 μL /mL）培养，                 α⁃SMA⁃F  GGAGAAGCCCAGCCAGTCGC         65
                置于37 ℃、5% CO2培养箱中。待培养基中细胞生长                        α⁃SMA⁃R  CCCGCCTTACAGCCCGGA           64
                至 70%~80%时，用 1 mL 0.25%胰酶消化后进行传                    GAPDH⁃F TGGATTTGGACGCATTGGTC          58
                                                                   GAPDH⁃R TTTGCACTGGTACGTGTTGAT         58
                代培养，细胞培养至第 3~8 代用于实验。 收集对
                数期MC细胞接种于6孔板内，待细胞贴壁且融合至                           1.2.5  Western blot检测细胞蛋白表达量
                70%~80%无血清培养基同步化12 h后，再进行细胞                           依照分组干预细胞 24 h 后，用预冷的 PBS 洗涤
                转染及干预处理 24 h，用 TGF⁃β1（10 ng/mL） 干预                细胞 2 次，加入细胞裂解液，裂解液中含有 RIPA、
                                                       ［4］
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